质粒提不出和得率较低的原因分析

质粒提不出和得率较低的原因1 ) 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。2 ) 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体 。3 ) 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此，不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落，另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。4 ) 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分。5 ) 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。6 ) 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。7 ) 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。8 ) 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。9 ) 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如，洗脱缓冲液EB(10mM Tris•Cl，pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0～8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。