人可溶性凋亡相关因子(sFAS/Apo-1)ELISA试剂盒实验步骤

　　人可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1）ELISA试剂盒  本试剂盒仅供研究使用。　　检测范围： 48T 25 ng/L -800 ng/L　　使用目的：　　本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1）含量。　　实验原理　　本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1）水平。用纯化的人可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1），再与HRP标记的可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人可溶性凋亡相关因子（sFAS/Apo-1）浓度。　　标本要求　　1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融　　2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。　　操作步骤　　1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照说明书中所示在小试管中进行稀释。　　2. 加 样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样 品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。　　3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。　　4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用　　5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。　　6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。　　7. 温育：操作同3。　　8.洗涤：操作同5。　　9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.　　10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。　　11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。　　注意事项：　　1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。　　2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。　　3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。　　4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。　　5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。　　6．底物请避光保存。　　7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.　　8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。　　9．本试剂不同批号组分不得混用。　　10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。　　保存条件及有效期　　1．试剂盒保存：；2-8℃。　　2．有效期：6个月