人角化细胞生长因子(KGF)ELISA试剂盒操作步骤

中文名称：人角化细胞生长因子(KGF)ELISA试剂盒英文名称：HumanKeratinocyteGrowthFactor,KGFELISAKit检测范围： 48T 25 ng/L -800 ng/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本角化细胞生长因子（KGF）含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人角化细胞生长因子（KGF）水平。用纯化的人角化细胞生长因子（KGF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入角化细胞生长因子（KGF），再与HRP标记的角化细胞生长因子（KGF）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的角化细胞生长因子（KGF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人角化细胞生长因子（KGF）浓度。试剂盒内容及其配制：试剂盒成份96孔配置48孔配置96/48人份酶标板1块板（96T）半块（48T）塑料膜板盖1块半块标准品1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）标准品稀释缓冲液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）生物素标记抗体1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）亲和链酶素-HRP1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）自备材料：1.蒸馏水。2.加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。3.振荡器及磁力搅拌器等。人角化细胞生长因子(KGF)ELISA试剂盒样品收集、处理及保存方法：1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。3、细胞上清液---1000×g离心10分钟除颗粒和聚合物。4、组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液5、保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。操作注意事项：试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。安全性：1.避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2.实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3.不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。人角化细胞生长因子(KGF)ELISA试剂盒试剂盒性能：1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。2. 特异性：不与其它细胞因子反应。3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。操作步骤：1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。3.加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。4.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。5.每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。6.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。7.每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。8.取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。9.在450nm波长处测定各孔的OD值。结 果 判 断 与分析：1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度, 再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。