Vanquish Core高通量并联分析用于药物溶出度测试

本文采用赛默飞Vanquish Core双三元高效液相色谱并联系 统和深圳锐拓RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，按照仿制 药一致性评价体外溶出度的测试要求，结合变色龙软件自定 义报告模板对水杨酸测试片进行了高通量溶出度测试，方法 快速、简便、准确，而且可自动生成溶出曲线，计算F2值， 可作为制药行业客户高效开展各类型仿制药一致性评价的参考。thermoscientific Vanquish Core 高通量并联分析用于药物溶出度测试 冉良骥吴燕娇金燕 赛默飞世尔科技（中国）有限公司色谱质谱部 关键词 Vanquish Core ，双三元，溶出度，一致性评价，溶出曲线，相似因子 F2 摘要 本文采用赛默飞 Vanquish Core 双三元高效液相色谱并联系统 和深圳锐拓 RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，按照仿制药 一致性评价体外溶出度的测试要求，建立了溶出度测试的高 通量液相分析方法；结合赛默飞变色龙软件自建的溶出度测 试报告模板，可根据测试结果自动生成溶出曲线，直接计算 相似因子 F2值，可有效助力制药客户提升仿制药一致性评价 的研发效率。 1．前言 自 2016年国家药监局明确一致性评价相关指导原则和申报流 程以来，经过数年探索和发展，已有多家企业获得了一致性 评价批文，截至 2020年 8月，全国已有 600家企业积极参与 到一致性评价中，共 533个品种、2319个药品获得受理。但 随着一致性评价的不断深入，以及相关鼓励政策（如 4+7带 量采购）的实施，制药企业也面临着愈发激烈的市场竞争。 现阶段仿制药一致性评价中，溶出度研究普遍采用多种溶出 条件下，将仿制药与参比制剂进行体外溶出曲线对比，考察 两者体外药物溶出速度和程度的相似性。虽然溶出曲线相 似，并不意味着两者就生物等效，但充分有效的溶出度研究 能显著降低 BE 失败的风险。为了发现更具区分力的溶出方 法，往往需要经过多次试验才能筛选出合适的溶出介质和溶 出条件，而如何压缩这个过程带来的时间成本，提高各种口 服制剂以及复杂注射剂体外溶出度（或释放度）测试的效率 和准确度，为处方研究和工艺确认提供更可靠的数据支持，依然是困扰药企研发部门和 CRO 公司的巨大挑战。 本文的溶出度测试以水杨酸标准片为测试样品，采用深圳锐 拓生产的 RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，可自动同步完 成 12个样品不同时间点的取样和过滤操作，与常规的 6杯或 8杯溶出度仪相比，可更好的满足《普通口服固体制剂溶出 曲线测定与比较指导原则》中单次试验 12个样品量的测试要 求；液相色谱分析过程采用赛默飞 Vanquish Core 双三元高 效液相色谱并联系统，该系统可在一台液相系统上同时开展 两种相同或不同的方法测试，结合 UHPLC 测试方法，可将测 试通量提高一倍甚至数倍以上；数据处理过程结合了变色龙 软件强大的报告编辑功能，采用自定义的溶出度报告模板，结合测试结果自动生成溶出曲线，直接计算相似因子 F2值，减少了繁琐的手动计算，降低了不同软件平台间的数据转录 风险。 相比传统的溶出度测试流程，整个试验过程更加简便、高效 和准确，且测试结果完全符合测试要求，可有效助力制药行 业提升仿制药一致性评价的研发效率。 2．实验方法 2.1仪器 Thermo Fisher Vanquish Core 高效液相色谱仪 泵：Vanquish Dual Pump （含两个独立三元梯度泵） 自动进样器：Vanquish Dual sampler FT （含两个独立的自动 进样针） 柱温箱：Vanquish Column Compartment 检测器：两个独立的 Vanquish Diode Array Detector 2.2软件 Chromeleon 7.3 2.3试剂 甲醇、乙酸（色谱级，Fisher ），磷酸二氢钾、氢氧化钠（色谱级，CNW ），去离子水（18.2MQ@25°C ，Millipore 纯 水机）。 2.4标准品和样品 水杨酸对照品（中国食品药品检定研究院） 水杨酸标准片（300mg/片，非崩解型溶出度标准片，中国 食品药品检定研究院） 2.5样品前处理 2.5.1溶出介质制备 取磷酸二氢钾 81.6g ，加氢氧化钠 18.96g ，用去离子水稀释 至 12000ml ，即得磷酸盐缓冲液（pH ＝7.40±0.05），作为 溶出介质待用。 2.5.2对照品溶液 精密称量水杨酸对照品 31.7mg ，以溶出介质溶解并定容至 100mL 。 2.5.3溶出度测定（桨法） 取配制好的溶出介质各 900ml ，分别置于已通过机械性能验证 的自动溶出仪的 12个溶出杯内，设定溶出温度为 37.0±0.5℃，调 整浆叶转速为 100转 /分钟，待溶出温度恒定后，通过自动投药 器将 12片水杨酸片同时投入 12个溶出杯中，并开始同步计时，通过自动取样器先后于投药后 5、10、15、30、45、60分钟时取 样 10 mL ，并通过管路终端 0.45 um 孔径滤膜自动滤过，作为溶 出曲线测试的供试品溶液。（取样后自动取液器向各溶出杯自 动补充空白溶出介质各 10 mL ） 取另一批次的水杨酸片，重复上述操作，获得对应的样品溶 液，作为参比制剂溶出曲线测试的供试品溶液（用于 F2值计 算）。 图 1 RT612-AT 12杯自动取样溶出仪 2.5.4样品溶液的测定 取自动溶出仪于各个时间点吸取的溶出度样品，以 Vanquish Core 并联系统采用以下相同的色谱条件进行测定，其中左泵 流路和右泵流路分别测定不同批次的样品溶液。 表 1色谱条件 色谱柱 Hypersil Gold，2.1×50mm，1.9 um；P/N：25002-052130 柱温 30℃ 流动相 甲醇-2%乙酸（40:60） 流速 0.4 mL/min 检测器 296 nm 进样量 2 uL 图 2 Vanquish Core 液相系统连接示意图 3．实验结果和讨论 3.1溶出条件的控制 溶出参数的稳定性将直接影响试验结果的准确度和精密 度，RT612-AT 12杯自动取样溶出仪采用自动定位取样针、一体成型圆角设计水浴槽，非驻留式温度探头等多项技术，确保溶出温度和转速在整个溶出度测定过程的均一性，并可 自动生成完整的溶出参数在线监测报告，方便数据的审计追 踪和定期回顾。 图 3 溶出度仪在线监测报告 3.2液相条件的优化 为尽可能减少液相分析的时间消耗，本试验采用如下尝试，并取得了不错的效果： ⑴采用并联系统同时开展供试和参比两组试验数据的测试，由于进样器为独立双针设计，结合双三元泵，实现了一套仪 器两条流路独立运行，无交叉污染高效分析，可提高测试通 量达 100%； 图 4 Vanquish 并联系统与常规系统分析时间比较 ⑵采用 Hypersil Gold 1.9µm 超快速色谱柱，待测物主峰 在 1.3min 即可完成分析；同时为降低进样过程带来的时间 消耗，通过变色龙软件内置的“准备下一针”脚本命令 【SamplerModule.Sampler.PrepareNextInjection 】，可在上 一针分析结束前，提前吸取下一针样品，从而实现零延迟进 样分析。 3.3试验结果的处理 溶出度试验会产生大量的测试数据，常规方法需要计算各个 时间点的浓度数据，结合溶出时间，样品杯号等信息进行 数据归类，然后按照统计学方法计算各时间点的 RSD ，以及 溶出曲线相似度的 F2值。由于常规色谱分析软件拓展性的 限制，客户往往需要将数据转移至 Excel 文档中进行二次处 理，但数据转移过程极易产生不必要的疏漏和偏差，而且也 给对应的计算机化系统验证，数据权限管理带来了挑战。 赛默飞变色龙软件系统可通过自定义变量等工具对进样序列 中的数据添加合理标识（如溶出杯号，溶出采样时间点等），结 合报告设计器中大量与 Excel 完全相同的变量工具，用户可以 自行设计各种复杂的报告模板，自动完成海量数据（包括但不 限于如溶出度试验测试）的完整分析。 下图是由变色龙软件自动生成的本次试验的溶出度测试报 告，数据分析与样品测试同步完成，且所有数据完全符合相 关测试要求。 注：本试验采用水杨酸测试片，并非正规药物，溶出测试条 件参照中国食品药品检定研究院发布的水杨酸片使用说明 书，其溶出曲线仅供本次方法验证。 Dissolution curve report Sequence Details Da t a L oca t ion: De mo D i sso l u t i o n t es t A c q .Op e ra t or c m admin P rint T ime: 2019/12/28 Se qu e n c e Name : 20191217 D issol u t i o n Test Integration Result: Sample batch: 20170601 Medium: pH7.4PBS Sample Specifications 300 APE Salicylic Acid Dissolution Volume: 900 Rehydration Volumn: 10 Standard Weight: 31.700 Standard Purity. 99.7% Standard Dilution: 100 Time /min Numbe r of Cups A-Dissolution (%) ARSD(%) B-Dissolution(%) B RSD(%) Result 0 12 0 0 3.5 0 5 12 3.8 4.61 4.51 Pass 10 12 7.7 4.64 7.1 4.50 Pass 15 12 11.6 4.33 10.7 4.42 Pass 30 12 22.5 4.73 20.9 4.64 Pass 图 5变色龙软件自动生成的溶出曲线测试报告 结论 本文采用赛默飞 Vanquish Core 双三元高效液相色谱并联系 统和深圳锐拓 RT621-AT 12杯自动取样溶出度仪，按照仿制 药一致性评价体外溶出度的测试要求，结合变色龙软件自定 义报告模板对水杨酸测试片进行了高通量溶出度测试，方法 快速、简便、准确，而且可自动生成溶出曲线，计算 F2值，可作为制药行业客户高效开展各类型仿制药一致性评价的参 考。 参考文献 [1]中国药典 2020版第四部 0931通则溶出度和释放度测定 [2] CFDA 2016年 106号文《总局关于落实《国务院办公厅关 于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》有关事项的 公告》 [3] CFDA 普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则