蜜饯和糖果中8种合成着色剂的测定

蜜饯和糖果中8种合成着色剂的测定（Copure® PWAX混合型弱阴离子交换柱）《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》食品合成着色剂，也称为食品合成染料，被广泛应用到食品的加工过程中。鉴于合成着色剂的不安全性，国家加强了对这类合成着色剂的监管，制订了食品合成着色剂的测定标准（GB5009.35-2016）。逗点生物依据国标的征求意见稿，建立了固相萃取-高效液相色谱法测定食品中8种合成着色剂含量的方法，样品经乙醇氨水提取后，经PWAX混合型弱阴离子交换柱净化，采用高效液相色谱仪结合紫外检测器测定。经验证，8种合成着色剂在0.10 μg/mL到10 μg/mL范围内线性良好，R^2>0.995，加标回收率在80%-110 %范围内，符合测试需求。1、 样本前处理1.1样品提取    准确称取样品2 g（精确至0.001 g），置于50 mL具塞离心管中，加入25 mL乙醇氨水溶液（硬糖需要先加入2 mL水超声使其溶解），涡旋1 min，50℃超声提取20 min，8000 转/分钟离心5 min，取上清液置于50 mL离心管中，残渣中再加入15 mL乙醇氨水溶液重复提取1次，离心后合并上清液，用乙醇氨水溶液定容至50 mL，即得提取液。准确吸取提取液10 mL，50℃下氮气浓缩至2 mL左右，分2~3次共加入10 mL 5%甲醇水溶液溶解，作为待净化液。注：乙醇氨水溶液配制，量取无水乙醇700 mL，加入4 mL氨水，用水稀释并定容至1 L，混匀。1.2试样的净化浓缩先依次用6 mL甲醇和6 mL水活化WAX固相萃取柱（150 mg/6 mL），保持柱体湿润，将待净化液注入柱中，控制流出液流速在1滴/秒，弃去流出液。再依次用6 mL 2%甲酸水和6 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱。最后用6 mL 2%氨化甲醇洗脱，分两次加入，收集洗脱液，于50 ℃氮吹至近干。准确加入2 mL pH=9的乙酸铵溶液溶解，过0.45 μm PTFE滤膜，弃去2~5滴初滤液，取续滤液作为待测液。1.3空白实验1.3.1过程空白：取一支洁净的50 mL具塞离心管，不称取试样，按照上述1.1和1.2进行提取、净化，浓缩，取续滤液上机测试。1.3.2空白本底实验称取样品2 g（精确至0.001 g）按照上述1.1和1.2进行提取、净化，浓缩，取续滤液上机测试。2、 标准系列工作液精密移取着色剂混标中间液（1 μg/mL）0.10 mL、0.20 mL于2个1 mL色谱瓶中，再吸取混合标准中间液（10 μg/mL）0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50mL于3个1 mL色谱瓶中，分别用水定容至1 mL，混匀，得标准系列工作液。浓度分别为0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL和10.0 μg/mL。3、 仪器条件仪器：ThermoFisher U3000液相色谱仪色谱柱：CommaSil® C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)流动相：A：20 mmol/L乙酸铵溶液 B：甲醇洗脱方式：梯度洗脱，见表1流速：1 Ml/min柱温：30 ℃进样量：10 Μl检测器：紫外检测器检测波长：415 nm、520 nm、610 nm表1 梯度洗脱程度时间/minA/%B/%0.01901012.0653519.0554522.5505023.0455524.0356534.0356535.0901042.090104、 实验结果4.1 加标回收表1 加标浓度7.5 mg/kg竞品比对结果样品化合物平均回收率（%）n=3Copure®A品牌D品牌山楂柠檬黄91.395.494.3新红95.596.194.3苋菜红94.493.193.6胭脂红92.388.985.8日落黄92.695.395.1诱惑红94.596.296.0 赤藓红94.590.671.2亮蓝94.495.793.7表2 加标浓度12.5 mg/kg竞品比对结果样品化合物平均回收率（%）n=3Copure®A品牌D品牌硬糖柠檬黄92.896.9100新红10399.8103苋菜红10598.2101胭脂红10665.390日落黄82.780.880.1诱惑红103103101赤藓红88.380.377.3亮蓝10197.396.4图1 加标浓度为7.5 mg/kg时山楂中8种合成着色剂液相色谱图图2 加标浓度为12.5 mg/kg时硬糖中8种合成着色剂液相色谱图5、 注意事项1.在使用乙醇氨水溶液提取时，需要提取两次以上，提取一次可能会导致提取不充分，导致回收率偏低。2.过柱前确认样液的Ph值＜6，以便于合成着色剂目标化合物和填料PWAX更好的结合。3.上机之前过滤所用的针式过滤器不能使用尼龙针式过滤器，会吸附部分合成着色剂，导致回收率偏低，建议使用PTFE亲水针式过滤器。4.在检测赤藓红时，需要注意在使用离心管氮吹时会有少量的赤藓红会附着在离心管上，可以采用涡旋和超声的方法进行溶解，使用玻璃的氮吹管更易溶解；或者在溶解的时候加入一定量的甲醇便于赤藓红的溶解。六、订购信息货号描述包装COPWAX6150Copure®混合型弱阴离子交换柱，PWAX,150 mg/6 Ml30支/盒HC1801CommaSil® C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)1根/盒SDC-3000-Dbiocomma® 多管涡旋混匀仪1台/箱BN24biocomma® 24孔智能氮吹仪1台/箱SF130-22-PTFE-HL亲水性PTFE针式过滤器，直径13mm，孔径0.22 μm，有机系100个/盒SC2-12 mL蓝色聚丙烯盖，白色PTFE/红色硅胶垫，9-425100个/盒V2-AL-N2 mL螺纹棕色样品瓶，带书写处11.6*32 mm，9-425100个/盒蜜饯和糖果中 8种合成着色剂的测定 （Copure®PWAX 混合型弱阴离子交换柱） 《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》 食品合成着色剂，也称为食品合成染料，被广泛应用到食品的加工过程中。鉴于合成着色剂的不安全性，国家加强了对这类合成着色剂的监管，制订了食品 合成着色剂的测定标准（GB5009.35-2016）。 逗点生物依据国标的征求意见稿，建立了固相萃取 -高效液相色谱法测定食 品中 8种合成着色剂含量的方法，样品经乙醇氨水提取后，经 PWAX 混合型弱 阴离子交换柱净化，采用高效液相色谱仪结合紫外检测器测定。经验证，8种合 成着色剂在 0.10μg/mL 到 10μg/mL 范围内线性良好，R^2>0.995，加标回收率在 80%-110%范围内，符合测试需求。 一、样本前处理 1.1样品提取 准确称取样品 2g （精确至 0.001g ），置于 50mL 具塞离心管中，加入 25mL 乙醇氨水溶液（硬糖需要先加入 2mL 水超声使其溶解），涡旋 1min ，50℃超声 提取 20min ，8000转 /分钟离心 5min ，取上清液置于 50mL 离心管中，残渣中再 加入 15mL 乙醇氨水溶液重复提取 1次，离心后合并上清液，用乙醇氨水溶液定 容至 50mL ，即得提取液。准确吸取提取液 10mL ，50℃下氮气浓缩至 2mL 左右，分 2~3次共加入 10mL5%甲醇水溶液溶解，作为待净化液。 注：乙醇氨水溶液配制，量取无水乙醇 700mL ，加入 4mL 氨水，用水稀释并定容至 1 L ，混匀。 1.2试样的净化浓缩 先依次用 6mL 甲醇和 6mL 水活化 WAX 固相萃取柱（150mg/6mL ），保持柱 体湿润，将待净化液注入柱中，控制流出液流速在 1滴 /秒，弃去流出液。再依次 用 6mL2%甲酸水和 6mL 甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱。最后用 6mL2%氨 化甲醇洗脱，分两次加入，收集洗脱液，于 50℃氮吹至近干。准确加入 2mLpH=9的乙酸铵溶液溶解，过 0.45μmPTFE 滤膜，弃去 2~5滴初滤液，取续滤液作为待 测液。 1.3空白实验 1.3.1过程空白：取一支洁净的 50mL 具塞离心管，不称取试样，按照上述 1.1和 1.2进行提取、净化，浓缩，取续滤液上机测试。 1.3.2空白本底实验 称取样品 2g （精确至 0.001g ）按照上述 1.1和 1.2进行提取、净化，浓缩，取 续滤液上机测试。 二、标准系列工作液 精密移取着色剂混标中间液（1μg/mL ）0.10mL 、0.20mL 于 2个 1mL 色谱瓶 中，再吸取混合标准中间液（10μg/mL ）0.05mL 、0.10mL 、0.20mL 、0.50mL 于 3个 1mL 色谱瓶中，分别用水定容至 1mL ，混匀，得标准系列工作液。浓度分 别为 0.10μg/mL 、0.20μg/mL 、0.50μg/mL 、1.00μg/mL 、2.00μg/mL 、5.00μg/mL 和 10.0μg/mL 。 三、仪器条件 仪器：ThermoFisher U3000液相色谱仪 色谱柱：CommaSil® C18 (4.6 mm×250mm ，5μm) 流动相：A ：20mmol/L 乙酸铵溶液 B ：甲醇 洗脱方式：梯度洗脱，见表 1 流速：1Ml/min 柱温：30℃ 进样量：10Μl 检测器：紫外检测器 检测波长：415nm 、520nm 、610nm 表 1梯度洗脱程度 时间/min A/% B/% 0.01 90 10 12.0 65 35 19.0 55 45 22.5 50 50 23.0 45 55 24.0 35 65 34.0 35 65 35.0 90 10 42.0 90 10 四、实验结果 4.1加标回收 表 1加标浓度 7.5mg/kg 竞品比对结果 样品 化合物 平均回收率（%）n=3 Copure® A品牌 D品牌 山楂 柠檬黄 91.3 95.4 94.3 新红 95.5 96.1 94.3 苋菜红 94.4 93.1 93.6 胭脂红 92.3 88.9 85.8 日落黄 92.6 95.3 95.1 诱惑红 94.5 96.2 96.0 赤藓红 94.5 90.6 71.2 亮蓝 94.4 95.7 93.7 表 2加标浓度 12.5mg/kg 竞品比对结果 样品 化合物 平均回收率（%）n=3 Copure® A品牌 D品牌 硬糖 柠檬黄 92.8 96.9 100 新红 103 99.8 103 苋菜红 105 98.2 101 胭脂红 106 65.3 90 日落黄 82.7 80.8 80.1 诱惑红 103 103 101 赤藓红 88.3 80.3 77.3 亮蓝 101 97.3 96.4 12章 220 240 20 340 第 0 图 1加标浓度为 7.5mg/kg 时山楂中 8种合成着色剂液相色谱图 图 2加标浓度为 12.5mg/kg 时硬糖中 8种合成着色剂液相色谱图 五、注意事项 1.在使用乙醇氨水溶液提取时，需要提取两次以上，提取一次可能会导致提 取不充分，导致回收率偏低。 2.过柱前确认样液的 Ph 值＜6，以便于合成着色剂目标化合物和填料 PWAX 更好的结合。 3.上机之前过滤所用的针式过滤器不能使用尼龙针式过滤器，会吸附部分合 成着色剂，导致回收率偏低，建议使用 PTFE 亲水针式过滤器。 4.在检测赤藓红时，需要注意在使用离心管氮吹时会有少量的赤藓红会附着 在离心管上，可以采用涡旋和超声的方法进行溶解，使用玻璃的氮吹管更易溶解；或者在溶解的时候加入一定量的甲醇便于赤藓红的溶解。 六、订购信息 货号 描述 包装 COPWAX6150 Copure®混合型弱阴离子交换柱，PWAX,150mg/6Ml 30支/盒 HC1801 CommaSil® C18 (4.6mm×250mm，5 μm) 1根/盒 SDC-3000-D biocomma®多管涡旋混匀仪 1台/箱 BN24 biocomma® 24孔智能氮吹仪 1台/箱 SF130-22-PTFE-HL亲水性 PTFE针式过滤器，直径 13mm，孔径 0.22 μm，有机系 100个/盒 SC2-1 2mL蓝色聚丙烯盖，白色 PTFE/红色硅胶垫，9-425 100个/盒 V2-AL-N 2mL螺纹棕色样品瓶，带书写处 11.6*32mm，9-425 100个/盒