实时荧光定量PCR实验用水指南

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，简称qPCR,是在PCR反应体系中加入荧光物质（荧光染料或荧光标记的特异性探针），利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。水中的颗粒物，离子含量，有机物及细菌微生物等杂质对实验都会带来影响，水中的颗粒物，离子含量，有机物及细菌微生物等杂质对实验都会带来影响，值得关注的因素有以下两个方面：DNA酶和RNA酶&镁离子，乐枫的Genie G一体超纯水机和Genie PURIST超纯水机，这两种纯水设备都可以符合实时荧光定量PCR反应的用水要求。实时荧光定量PCR实验用水指南 基于实时荧光定量PCR的核酸检测技术在新冠病毒快速鉴定及确诊中发挥了 重要作用。本文，乐枫纯水将带你一起探讨实时荧光定量PCR实验的用水要求。什么是实时荧光定量PCR？ 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术是在PCR反应体系 中加入荧光物质（荧光染料或荧光标记的特异性探针 ），利用荧光信号积累实时 监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 与普通PCR相比，实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞 跃。运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。实验流程： 影响因素： 1. DNA酶和RNA酶 DNA酶和RNA酶能够特异性地降解DNA和RNA。在进行实时荧光定量 PCR时，去除这两种酶从而保证提取的RNA和DNA样本的完整性十分关键。尤其 在提取RNA的时候，RNA极易被降解。这是因为RNase 非常稳定，且无处不在，用常规的高温高压蒸汽方法和蛋白酶抑制剂不能使所有的RNase完全失活。如果 样本中的 核酸被降解，会影响检测结果的准确性，甚至造成假阴性检测结果。 因此，实时荧光定量PCR实验用超纯水必须有效降低DNA酶和RNA酶的含 量，减少 对实验的影响。 2.镁离子 实时荧光定量PCR实验需要根据不同的引物对和模板确定最佳的镁离子浓度。 Mg2+浓度过低，会影响DNA聚合酶的活性，导致产量降低，影响实 时定量的 敏感性； Mg2+浓度过低，会增加引物二聚体的形成，这会影响特异性。 因此，实时荧光定量PCR实验用超纯水必须控制 Mg2+浓度，避免背景因素带 来的不确定性。 用水要求： 实时荧光定量 PCR推荐使用超纯水 用水要求 电阻率 18.2MQ·cm TOC 5 ppb 微生物 < 0.01 cfu/mL RNase 无 DNase 无 选型指导： 乐枫的Genie G一体超纯水机和Genie PURIST超纯水机等，可以满足 实 时荧光定量PCR 反应的用水要求。 Genie系列超纯水机，可以配置独创配方填料的低镁型纯化柱，不但可以广 谱去除水中的金属离子，还可以特异性去除水中的镁离子，保证超纯水中Mg2+对qPCR实验零干扰。 乐枫的终端RephiBio滤器通过带电荷的尼龙膜，可以去除DNA酶和RNA 酶，避免核酸酶对实验的影响。 G e nie PU R IS T 进 水 纯水 产 水超纯水 电 阻 率 18.2MQ·cm TOC 2 ppb 颗粒 无粒径超过0.22um 的颗粒 微生物 <0.01 cfu/ml 热 原含 量 <0.001 Eu/ml RNase <0.5 pg/ml DNase <10 pg/ml 作为高端纯水系统，Genie系列纯水机水质稳定，具有第三方省级以上检 测机构出具的产水水质检测报告；乐枫的RephiBio终端滤器，具有热源、DNase和RNase的检测报告。辛劳的检测实验者使用Genie系列超纯水机，可 以确保超纯水对qPCR反应的不确定性降至最低，完全可以“用水无忧”。 关键词：新冠肺炎,纯水, PCR,聚合酶链式反应, Taq,上海乐枫, RephiLe, Genie纯水机, Super-Genie纯水机