植入了骨修复材料的小型猪腰椎椎体不脱钙病理组织切片制备方法

用于骨修复的生物材料及器械在进行临床试验前均需要进行临床前安全性和有效性动物试验研究，以预测其应用于临床可能发生的不良作用[1，2]。骨修复材料的动物试验研究需要制备合适的骨缺损动物模型，将骨修复材料植入到制备的骨缺损区域，评价骨缺损部位的局部炎症反应、骨整合程度、骨重建情况，对该骨修复材料的安全性及有效性进行评价[3，4]。生物材料及医疗器械动物试验周期结束后，需要剖检、取样，切取连带植入物及其周边骨组织进行病理组织切片制备，以观察生物材料及医疗器械与宿主骨组织结合界面的结合情况及其在动物体内的吸收降解情况。与普通的石蜡包埋组织切片制备方法相比，埋置有植入物的骨组织标本进行组织切片制备时采用树脂包埋病理组织切片制备方法不需要进行脱钙处理，不需要额外剔除组织内埋置的植入物，可完整的观察到植入物与宿主骨组织结合界面的组织反应情况，实现对植入物与骨组织结合界面组织细胞学变化的研究。本研究对植入了骨修复材料小型猪腰椎椎体不脱钙病理组织切片制备方法进行了研究，以期能为相关研究人员提供参考。 1.1   材料1.1.1 组织标本按照《医疗器械动物试验研究注册审查指导原则第二部分：试验设计、实施质量保证（2021 年第75 号）》进行骨修复材料产品安全性和有效性评价动物试验研究方案的设计与实施[5]。试验研究制备小型猪腰椎椎体骨缺损动物模型，将委托方提供的骨修复材料植入到制备的缺损部位，动物试验研究周期结束后获得了植入了骨修复材料的腰椎椎体骨组织标本。1.1.2 主要试剂及仪器设备主要试剂：10 %中性福尔马林溶液（购自济南百博生物技术股份有限公司），无水乙醇（购自国药集团化学试剂有限公司），苏木精染液、伊红染液及甲苯胺蓝染色试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司），Technovit 7200 光聚树脂（购自德国EXAKT 公司）。主要仪器设备：E300CP 型硬组织切片机、E400CS 型硬组织磨片机、E402 型平行粘片装置、E510 型脱水浸润仪、E520 型光固化包埋机、E530 型干燥渗透聚合装置、E312 型骨组织病理切割机（德国EXAKT公司）。（全部论文内容，请下载查看）植入了骨修复材料的小型猪腰椎椎体不脱钙病理组织切片制备方法 朱福余林振华孙立魁车国喜屈秋锦刘香东刘增祥刘成虎△ （山东省医疗器械和药品包装检验研究院国家药品监督管理局生物材料器械安全性评价重点实验室山东济南250101） 基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFB1104105）；山东省医疗器械和药品包装检验研究院内部科研课题（ZX202121）作者简介：朱福余（1988-），男，硕士，中级工程师，主要研究方向：医疗器械生物学评价；△通讯作者：刘成虎（1979-）， 男，博士，高级工程师，主要研究方向：医疗器械生物学评价 （收稿日期：2022-09-24接受日期：2022-10-20） 摘要目的：建立植入了骨修复材料小型猪腰椎椎体骨组织标本的不脱钙病理组织切片制备方法。 方法：将含骨修复材料的腰椎椎体骨组织标本进行分割暴露组织切面，梯度浓度乙醇脱水后经 Technovit 7200 VLC光聚树脂浸润，经黄蓝光共同辐照进行光聚合包埋，借助硬组织病理切磨 系统制备含骨修复材料不脱钙病理组织切片。 结果：结果显示通过上述方法制备的病理组织切片，经苏木精-伊红（HE）染色及甲苯胺蓝染色 后光学显微镜下观察能较好地显示骨的各种组织细胞结构，可清晰的观察到骨小梁的走向及连 接情况。 结论：研究建立了含骨修复材料骨组织标本病理组织切片制备方法，实现了含骨修复材料不脱钙 骨组织病理切片的制备，经病理染色后实现了带植入物的组织学观察，为生物材料及医疗器械动 物试验研究提供了新的病理检测手段及组织学评价途径。 关键词：小型猪腰椎椎体；含骨修复材料骨组织标本；树脂包埋法；不脱钙病理组织切片制备 中图分类号：R-33；R318.08文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）06-1017-05 前言 用于骨修复的生物材料及器械在进行临床试验前均需要进行临床前安全性和有效性动物试验研 究，以预测其应用于临床可能发生的不良作用[1，2]。骨修复材料的动物试验研究需要制备合适 的骨缺损动物模型，将骨修复材料植入到制备的骨缺损区域，评价骨缺损部位的局部炎症反应、骨整合程度、骨重建情况，对该骨修复材料的安全性及有效性进行评价[3，4]。生物材料及医疗 器械动物试验周期结束后，需要剖检、取样，切取连带植入物及其周边骨组织进行病理组织切片 制备，以观察生物材料及医疗器械与宿主骨组织结合界面的结合情况及其在动物体内的吸收降 解情况。与普通的石蜡包埋组织切片制备方法相比，埋置有植入物的骨组织标本进行组织切片制 备时采用树脂包埋病理组织切片制备方法不需要进行脱钙处理，不需要额外剔除组织内埋置的 植入物，可完整的观察到植入物与宿主骨组织结合界面的组织反应情况，实现对植入物与骨组织 结合界面组织细胞学变化的研究。本研究对植入了骨修复材料小型猪腰椎椎体不脱钙病理组织 切片制备方法进行了研究，以期能为相关研究人员提供参考。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1组织标本 按照《医疗器械动物试验研究注册审查指导原则第二部分：试验设计、实施质量保证（2021年 第75号）》进行骨修复材料产品安全性和有效性评价动物试验研究方案的设计与实施[5]。试验 研究制备小型猪腰椎椎体骨缺损动物模型，将委托方提供的骨修复材料植入到制备的缺损部位，动物试验研究周期结束后获得了植入了骨修复材料的腰椎椎体骨组织标本。 1.1.2主要试剂及仪器设备 ⚫ 主要试剂： 10 %中性福尔马林溶液（购自济南百博生物技术股份有限公司），无水乙醇（购自国药集团化学 试剂有限公司），苏木精染液、伊红染液及甲苯胺蓝染色试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司），Technovit 7200光聚树脂（购自德国EXAKT公司）。 ⚫ 主要仪器设备： E300CP型硬组织切片机、E400CS型硬组织磨片机、E402型平行粘片装置、E510型脱水浸润 仪、E520型光固化包埋机、 E530型干燥渗透聚合装置、E312型骨组织病理切割机（德国EXAKT公司）。 1.2方法 1.2.1组织标本的固定 将切取下的小型猪椎体骨组织标本放入10%中性福尔马林溶液中进行固定，固定24h后，更换新 的10%中性福尔马林溶液，进一步继续固定，固定时间不少于1周。 1.2.2组织标本的切割 取材将充分固定后的骨组织标本借助E312型骨组织病理切割机切割为约7mm厚度的标本，置于 10%中性福尔马林溶液中继续固定至少12h，流水冲洗至少1h，以水置换出组织中渗透的固定液。 1.2.3组织标本的脱水及浸润 在抽真空条件下将固定充分经流水冲洗后的骨组织标本逐级浸入梯度乙醇进行脱水处理，脱水 程序见表1。 表1组织标本脱水程序 Table 1 De h yd r a tion p r ocedure for t i ssue spe c imens Volume fraction of ethanol Time (under vacuum and negative pressure) 50% 72h 70% 72h 80% 72 h 90% 72h 95% 72h 100%Ethanol1 72h 100 %EthanolⅡ 72 h 在抽真空条件下将脱水完全的骨组织标本逐级浸入不同体积比的Technovit 7200VLC树脂/乙 醇混合液中进行浸润处理，浸润程序见表2。 表2组织 标 本树脂浸润程序 Table 2 Resin i nf i ltr a t i on p roced u re fo r t i s sue s p ecimen s Technovit 7200VLC resin/ethanol with different volume ratios Time (under vacuum and negative pressure) 30/70% 72h 50/50% 72h 70/30% 72h 100% Technovit 7200VLC Resin I 14d 100% Technovit 7200VLC ResinⅡ 14d 1.2.4组织标本的光固化包埋聚合 取出浸润完全的骨组织标本置入光固化包埋专用的模具中，加入光聚树脂，借助EXAKT 530干燥 渗透聚合装置进行抽真空处理，排净包埋模具内残存的气泡后进行固化聚合操作。固化过程由低 强度的黄光与高强度的蓝光共同辐照完成，先黄光辐照6h后蓝光辐照8完成骨组织标本的光固 化聚合。含骨修复材料的腰椎椎体骨组织标本光固化包埋标本块，见图1。 图1含骨修复材料 的 腰椎椎体骨组织 标 本树脂包埋块，箭头 所 示为填 充的骨修复材料 Fi g .l R esi n -e m b ed d e d b l oc k o f l um b a r v e r te b r a l b o dy b o n e t i ss u e spe ci m e n c o n ta i n i n g b o n e re p ai r m a t e r ia l， A r ro w s sho w fi l led b o n e r e p a i r m a t e ri a l 1.2.5组织标本的平行粘片制作 将聚合过的组织标本树脂包埋块从包埋模具中取出，利用Technovit4000粘合剂套装将包埋有 骨组织的树脂包埋块黏于载玻片上。经EXAKT 300 CP硬组织切片机切割，暴露出需要的组织切 面，利用EXAKT 400CS硬组织磨片机对切面进行抛光处理，另取一张载玻片，在EXAKT 402载片 黏合装置上用Technovit 7210VLC精密粘合剂将该载玻片黏附于标本块的抛光面，组织标本的 平行粘片即制作完成。 1.2.6组织标本的切片及磨片 经EXAKT 300CP硬组织切片机将包埋有组织标本的树脂块进行切割，一般将切割厚度设为200- 300μm，切片完成后，取下切片，经EXAKT 400CS硬组织磨片机进行磨片操作，磨片过程中要用 到不同规格的研磨纸和抛光纸，先进行粗磨，再进行精磨，最后进行抛光处理，将组织磨至20μm 左右。含骨修复材料的腰椎椎体骨组织标本切磨片，见图2。 图2含骨修 复 材料的腰椎椎体 骨 组织切磨片 F ig.2 H i s t o pa t h o l ogi c a l s l ic e s of l um b ar v e r t e b ra l bod y w i t h b one repa i r m a t e r ia l No t e ： A rr o w s s ho w f i l le d b o n e re pai r m a ter ia l . 1.2.7含骨修复材料组织切片的染色 将制备的含骨修复材料的组织切磨片经蒸馏水充分清洗后，进行病理染色。含骨修复材料腰椎椎 体骨组织病理切片HE染色方法：苏木精染液30min，自来水充分冲洗，1%盐酸乙醇分化30s，流 水冲洗后再入温水返蓝，置伊红染色液5min，自来水冲洗，待组织切片自然干燥后经Technovit 7200VLC封片后，置光学显微镜下镜检观察。含骨修复材料腰椎椎体骨组织病理切磨片甲苯胺蓝 染色方法：将制备的骨组织标本病理切磨片置于体积分数1 %甲苯胺蓝染液中20min后，自来水 充分冲洗，待组织切片自然干燥后经Technovit 7200VLC封片后，置光学显微镜下镜检观察。 2结果 2.1制备的含骨修复材料小型猪腰椎椎体不脱钙骨组织病理切片HE染色结果 通过上述方法制备了含骨修复材料小型猪腰椎椎体不脱钙骨组织病理切片，经HE染色后，光学 显微镜下观察可见试验研究植入的骨修复材料，呈浅灰色。组织切片经HE染色后细胞核呈蓝色，胞质呈红色，胞核、胞质着色对比鲜明，骨组织细胞未见移位变形，可清晰辨认骨的各种细胞成 份，实现了含植入物不脱钙骨组织的组织细胞学观察，见图3。 图3含骨修复材料 的 腰椎椎体骨组织病理切片 HE 染色结果 F i g .3 Re sult o f HE sta i ni ng on t h e pa t h o l og i c a l s ect i o n of t h e bo ne t issu e o f t h e l u mb a r v e rte br a l b o dy conta i n ing bo n e r e p ai r ma t e r i a l No t e： (A )x 100 under t he micr o s co pe ； (B )x200 unde r t he mic ro sc o pe ； A r ro w s s h o w fil led b o n e r e p a i r m at e r ia l . 2.2制备的含骨修复材料小型猪腰椎椎体不脱钙骨组织病理切片甲苯胺蓝染色结果 含骨修复材料小型猪腰椎椎体不脱钙骨组织病理切片经甲苯胺蓝染色后，光学显微镜下观察可 见试验研究植入的骨修复材料，呈浅灰色。组织细胞经甲苯胺蓝染色后，能较好地显示骨的各 种组织细胞结构，可清晰的观察到骨小梁的走向及连接情况，可以观察到植入的骨修复材料与 宿主骨结合情况，见图4。 图4含骨修复材料的腰椎椎体骨 组 织病理切片甲苯胺蓝 染 色 结果 F i g.4 To l ui d ine bl u e sta in i n g r es ult s o f p a t h o l o g i c al s ecti o n s o f l u m b a r v e r t e b ra l b o d y bon e t i s s u e c o nt a in i n g b o ne repair mat e r i a l No t e ： (A )x 100 unde r t h e m ic ro s c o p e ；(B )x200 u n d e r t h e m i c r o sco pe ； A rr o w s s h o w f il l e d bone r e p a i r m a t e r i al. 3讨论 骨组织标本采用石蜡包埋法进行病理切片制作时，必须先用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、硝酸、甲酸等脱钙液对骨组织标本进行脱钙处理[6-8]。在骨组织内埋置有植入物的情况下石蜡包埋组 织切片并不适用，原因是硬化后的石蜡虽具有一定的硬度，但其硬度不足以支撑去切组织内包 埋的植入物，切片过程会造成蜡块碎裂[9-11]。 树脂包埋法制备病理组织切片与常规"石蜡包埋组织切片"相比，制片步骤更为复杂繁琐，制 片周期更长，组织标本需要历经组织切割暴露切面、梯度乙醇脱水、不同体积比的Technovit 7200VLC树脂/乙醇混合液浸润、光聚合包埋、制备平行粘片，切片、磨片，才可制备出一张不 脱钙的骨组织病理切片。 上述报道的骨组织病理切片制备方法所适用的病理染色方法少，这是其缺陷所在，造就了适用范 围受限。同时，这种方法制备病理切片周期长，仅组织标本的浸润处理过程就需要近40天。其 优点是骨组织制片过程中不需要脱钙处理，组织在埋置有植入物的情况下，不需要剔除植入物，这是"石蜡包埋组织切片"所实现不了的，上述报道的骨组织病理切片制备方法可作为传统的、经典的"石蜡包埋组织切片技术方法"的补充。 利用该技术方法制备含骨修复材料腰椎椎体不脱钙病理组织切片时，需注意以下细节： （1）若切取的骨组织标本体积较大，应延长固定时间且固定过程中，应多次更换新的固定液，骨组织标本经骨组织病理切割机分切后，应该继续固定至少12 h，以使组织标本得到充分的固 定。 （2）因不脱钙的骨组织标本致密紧实，应在抽真空负压的条件下进行骨组织标本的脱水、浸 润处理，以使组织标本脱水充分，树脂包埋液浸润更加完全，更利于后续的组织切片制备。（3）进行光聚合固化包埋时，应先利用干燥渗透聚合装置抽真空，排净包埋模具内残存的气泡，以免影响组织块的聚合、固化。 （4）平行粘片制作过程中应利用磨片机充分对需要观察的组织切面抛光处理，以免出现组织切 片厚薄不一现象。 （5）在磨片时，磨盘转速应设置的尽可能的低，以免造成植入的骨修复材料与宿主骨组织脱离，致使长入骨修复材料的新生骨组织丢失，影响后期的组织病理学分析。 与普通的石蜡包埋法病理组织切片制备方法不同，本研究采用Technovit 7200 VLC光聚树脂进 行骨组织标本光固化包埋，借助EXAKT硬组织病理切磨系统制备骨组织标本的不脱钙病理组织 切片，组织切片制备过程中所用的并不是传统的病理切片刀，而是镶嵌有金刚石的无齿切割带锯，以"锯"的形式对组织进行切割，制备组织切片。该方法制备的病理切片最显著的特点是不需要 对骨组织进行脱钙处理，可使骨组织结构形态保持完好，骨的矿化结构不被破坏，可用于含金属、陶瓷、骨水泥等骨修复材料的临床前安全性和有效性的骨缺损修复动物试验研究[12]。同时，该 技术方法制片过程中不需要剔除植入到骨组织中的植入物，保持了骨组织与植入物之间原有的 组织结构形态，可直观反应结合界面的组织生长结合情况，这对骨缺损修复试验的组织长入研究 具有重要意义，可用于3D打印多孔洞类材料组织长入等生物组织相容性研究[13]。 生物材料及医疗器械动物试验研究的目的是预测其应用于临床可能发生的不良反应，是医疗器 械临床前安全性评价必须进行的一项试验研究[14]。动物试验研究组织病理学评价是该评价体 系中重要的一环，用以确定产品组织相容性，是评价其安全性并判定是否可以应用于临床的重要 研究手段[15，16]。树脂包埋法制备病理组织切片无需进行脱钙处理，在动物试验研究中结合动 物活体亲骨荧光素标记技术，可实现动态测量骨修复过程中的新生骨矿化率和矿化速率，进行骨 形态计量学研究[17，18]。制备的病理组织切片最显著的特点是不破坏植入到骨组织中的植入物，保持了骨组织与植入物之间原有的组织结构形态，该技术方法结合扫描电镜技术，可实现观察成 骨细胞在骨修复材料表面及孔隙内附着及生长情况，从而判断骨修复程度，同时结合扫描电镜技 术可实现观察骨修复材料表面侵蚀及骨质沉积情况的研究[19-22]。 20世纪80年代，为研究骨组织的矿化程度及新骨形成情况，塑料包埋技术开始应用于骨组织病 理切片的制备，近年来许多实验室在塑料包埋方法上进行了创新，特别是在包埋聚合液及其聚合 条件方面做了多种改进[23-26]。有文献报道用甲基丙烯酸甲酯（MMA）及邻苯二甲酸二丁酯（DBP）为渗透剂，甲基丙烯酸甲酯为包埋剂，包埋聚合制备骨组织塑料包埋切片的技术方法，但这一制 片技术因操作烦琐，制作周期长，且塑料包埋块制备过程复杂，组织切片制备过程对温度要求高，目前该技术方法仍然在用，但未得到广泛应用[27，28]。本研究制备不脱钙骨组织病理切片包埋 剂采用的是光聚树脂，通过黄光与蓝光共同辐照完成组织包埋块的包埋聚合，与传统的"石蜡包 埋组织切片"方法及"塑料包埋技术"组织切片方法制备骨组织病理切片所用的包埋剂不同，组织标本的浸润处理及切片方式也不同。 本研究制备的含骨修复材料腰椎椎体不脱钙病理组织切片，光学显微镜下可清晰观察骨缺损部 位植入骨修复材料后组织结合界面骨的各种组织细胞结构，可进行骨缺损修复后骨组织重建进 程及炎症反应研究，适用于生物材料及医疗器械临床前动物试验安全性评价的组织病理学研究。 参考文献 [1]卢俊钦，杨鑫，李军，等.仿生修饰结合三维打印技术构建的胶原－聚己内酯支架可促进兔临界骨缺损修复[J].组织 工程与重建外科，2021， 17(1)： 1-7 [2]倪王成，胡琳驰，张维丹，等. 3D打印和CAD/CAM氧化锆种植体骨结合性能的动物实验评价[J].口腔医学， 2021，41(2)： 144-148 [3]张虎雄，李微，杨物鹏，等. 3D打印淫羊藿苷/脱钙骨基质修复兔股骨髁骨缺损[J].中国组织工程研究， 2020，24(34)： 5461-5466 [4]卢嘉蕊，权晶晶.骨缺损动物模型的研究进展[J].口腔医学研究，2021， 37(9)： 783-786 [5]国家药品监督管理局.《医疗器械动物试验研究注册审查指导原则第二部分：试验设计、实施质量保证》(2021年 第75号). 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