大鼠软骨下骨中显微结构检测方案(镶嵌机)

骨性关节炎是一种退行性关节疾病，以渐进性的关节损伤为主要特征，最终往往导致患者关节疼痛和残疾，极大地降低患者生活质量。骨性关节炎的病理过程很复杂，过去的研究主要集中在软骨的退变方面，最近软骨下骨的作用得到了越来越多的重视。事实上，关节软骨与其相邻的软骨下骨是紧密耦合的，作为一个单一的功能性单元共同作用。因此目前很多的研究关注软骨下骨在骨性关节炎进程中的变化，以及在骨性关节炎治疗中以此结构为靶向的必要性和有效性。骨性关节炎是一种多因素疾病。在临床中，不同原因所致的骨性关节炎，其病理过程不尽相同。为了明确软骨下骨在骨性关节炎发展过程中的作用，以往大量的研究采用不同的动物模型观察骨性关节炎发生和发展过程中软骨下骨的变化，结果显示不同类型动物模型中软骨下骨变化不尽相同，甚至会产生完全相反的变化。尽管软骨下骨的变化不尽相同，但最终都会导致骨性关节炎的发生，这些结果提示:软骨下骨可能存在一种稳态的结构，任何破坏这种稳态的行为都会导致软骨的损伤，最终导致骨性关节炎的发生。机械负荷被认为是肌肉骨骼系统中骨和软骨内稳态的一种调节器。以往的证据表明骨和软骨都能对机械负荷具有强度依赖性。跑步运动是一种非常常见的负重运动形式，大量的人体及动物试验探讨了跑步运动对骨的影响，但结论并不一致，运动强度被认为是导致这种不一致结果的重要因素。我们前期的动物实验发现:低强度到中等强度的跑步运动能维持软骨的内稳态，而高强度的运动则会导致软骨退化。然而跑步对软骨下骨的影响，以及与跑步强度的相关性目前尚不明确，因此本实验的第一个目的是探讨不同强度的跑台运动对大鼠软骨下骨显微结构的影响。本部分将在前期探讨不同强度跑步对大鼠关节软骨影响研究的基础上，采用Micro-CT进一步探讨不同强度跑步运动后大鼠胫骨平台软骨下骨(包括软骨下骨板和软骨下骨松质骨)的超微结构，并了解不同跑步强度情况下软骨下骨和软骨变化的相关性。以往很多的研究探讨了不同情况下软骨下骨结构和力学性能的改变，以及其对关节软骨的影响。目前主要是通过Micro-CT扫描骨小梁三维图像来直接观察其显微结构，并定量提供与分析三维结构的参数来对软骨下骨进行研究。Micro-CT对软骨下骨的研究包括对骨的量的分析，即骨密度，同时还包括对骨的质的分析，即骨小梁的空间与形态结构，如骨小梁间隙(trabecularseparation,TbSp;骨体积分数(BV/TV)，即骨小梁的体积(bone volume,BV)与样本的总体积(tota lvolume,TV)之比;骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th);软骨下骨板孔隙率(porosity);以及骨小梁各向异性的程度(Degree of Anisotropy,DA)等。尽管采用Micro-CT能反映软骨下骨超微结构的变化，但软骨下骨成分如何变化目前尚无报道。拉曼光谱分析法(Raman spectroscopy)是以印度科学家拉曼的名字命名的一项检测材料分子成分的技术。它根据拉曼散射效应原理，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动等方面信息，以获取有机物质和无机样本分子成分的信息，它的特点是能通过微创和无损伤的方法对样品进行定性和定量的分析。它被认为能有效的评估样本在分子水平的信息，并能以最小的损伤和非侵入的方法应用于一些生物样品的检测中，比如检测尿液中葡萄糖含量;体外对人血液中丙肝病毒的检测;颈动脉和冠状动脉粥样硬化;生物材料的骨诱导;一些骨疾病的检测;骨康复过程中骨合成和整合的检测以及对骨组织微观结构成分的检测。以往很多研究都提到应用拉曼光谱定量骨矿化和骨基质来评估骨质量，拉曼光谱也被不少作者证实能作为一种重要的检测手段对骨组织成分进行研究。本研究的第二部分将采用拉曼光谱技术探讨不同强度跑步运动后大鼠软骨下骨成分的变化，从组织成分的角度进一步了解不同跑步强度和软骨下骨、软骨变化之间的相关性。1、探讨不同强度的跑台运动对大鼠软骨下骨显微结构的影响。2、探讨不同强度跑步运动对大鼠软骨下骨成分和力学特性的影响。1、实验动物和运动方案24只180-220gSD大鼠随机分成四组，不运动组(sedentary control,SED)、低强度运动组(low-intensity running group,LIR)、中强度运动组(moderate-intensity running group,MIR)和高强度运动组(high-intensity running group,HIR)。以不运动组作为对照，运动组(包括低强度运动组、中强度运动组和高强度运动组)动物分别进行8周强度不同的跑台运动。2、标本处理8周跑台运动结束后，使用0.3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后处死，截取每个实验大鼠双侧胫骨并去除软组织，右侧胫骨近端行Micro-CT检测;使用硬组织切片机(EXAKT300 CP Band System,Norderstedt，德国)将左侧胫骨近端标本沿矢状面垂直切分成外侧和内侧二部分。每部分分别在冠状面3等分点处继续沿矢状面切开，将之分为3小部分，将中间部分标本放入-80℃冰箱中冻存，具体如图2.1所示。对大鼠左侧胫骨关节软骨的外侧部分和内侧部分分别行拉曼光谱分析，检测前先将标本放入4℃生理盐水中浸泡12h。拉曼光谱检测结束后，将进行过拉曼光谱检测的标本行硬组织切除术后，再进行微硬度检测。图2.1 胫骨近端矢状面切口 3、检测指标3.1 Micro-CT检测：对于软骨下骨板进行分析承载区域面积1.04x1.04平方毫米作为感兴趣的区域(region of interest，ROI)图1.2，然后使用CT.vol软件分析和计算，具体分析参数包括：骨密度、孔隙度和软骨下骨板厚度。对软骨下骨松质骨的的分析,通过ROI软件选中一个大小为1.04x1.04x0.52mm³的骨小梁长方体图1.4。具体测量参数包括：骨小梁厚度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁间隔、连接密度、各向异性的程度和结构模型指数。图1.2 大鼠胫骨软骨下骨板分析图图1.4 大鼠胫骨软骨下骨松质骨成像图3.2 拉曼光谱检测：通过峰值581cm-1与峰值1260cm-1的比率来代表矿物质与基质的比率；通过峰值1070cm-1与960cm-1的比率来代表碳酸盐与磷酸盐的比率；使用960cm-1波峰的半峰全宽的倒数(full-width half-maximal,FWHM)来代表骨的矿物结晶度。3.3 微硬度检测：显微硬度测量采用日本岛津公司的HMV-2型号显微硬度计测定。HMV-2显微硬度计分别测量胫骨软骨下骨板和软骨下骨松质骨部位，每个样本每个部位测量3次，取各个部位3次测量的平均值作为该部位的硬度值。、1、不同强度跑步运动对大鼠软骨下骨板的影响1.1 软骨下骨板Micro-CT结果：高强度组软骨下骨板BMD在外侧部位为1181±0.084g/cm³内侧部位为1217±0.076/cm³均显著高于不运动组(1.089±0.052g/cm³，1111±0.084g/cm³)(p=0030，p=0.050)。高强度组内侧软骨下骨板厚度(0.271±0016mm)显著高于不运动组(0232±0.043mm)(p=0.037)，在外侧部分同样发现高强度组软骨下骨板厚度高于不运动组，但是并没有出现显著性差异。高强度组软骨下骨板孔隙率在外侧部位为28.47±2.43%，内侧部位为30.48±1.61%，均显著低于不运动组(34.69±4.39%，47.22±3.63%)(p=0.047，p=0.001)。然而，与不运动组相比，低强度运动组和中等强度运动组的BMD、软骨下骨板厚度和孔隙率均无显著性差异。1.2 软骨下骨板Microhardness结果显示：在胫骨软骨下骨板外侧部位，HIR组的硬度值为49.7±3.24MPa显著高于SED组46.1±2.61MPa(p=0.001)和MIR组47.3±4.53MPa(p=0.045);LIR和MIR组分别为47.5±2.53MPa和47.3±4.53MPa，尽管较SED组有所增加，但并无显著性变化。同样的变化出现也出现在软骨下骨板内侧部位，HIR组的硬度值为52.27±2.64MPa显著高于SED组47.92±2.41MPa(p=0.002);LIR组和MIR组分别为48.51±2.61MPa和46.77±3.18MPa，与SED组相比并无显著性变化。1.3 软骨下骨板拉曼结果显示：高强度组外侧和内侧部分矿物质/基质分别显著性低于不运动组外侧和内侧(p=0021,p=0028)，说明软骨下骨板矿化程度降低。高强度组内侧部分碳酸盐/磷酸盐显著性高于不运动组(p=0.004)，磷酸盐/蛋白质则显著性低于不运动组(p=0.032)，这说明高强度组软骨下骨板重塑增加。高强度组外侧和内侧部分矿物质结晶度显著性高于不运动组外侧和大侧(p=0.002,p=0.006)。拉曼光谱数据表明与不运动组相比，高强度组重塑和矿物结晶度增加，矿化程度降低。2、不同强度跑步运动对大鼠软骨下骨松质骨的影响2.1 软骨下骨松质骨Micro-CT结果：与不运动组相比，高强度组外侧(p=0.035)和内侧(p=0.002)部分BMD显著性增加。高强度组内侧部位BV/TV显著性高于不运动组(p=0.026)，表明运动对松质骨的成骨起到了刺激作用。此外，高强度组外侧和内侧部分松质骨厚度分别显著高于不运动组外侧(p=0.012)和内侧(p=0.027)，松质骨分离度在内侧部分低于不运动组(p=0.047)。通过高强度组SMI和CD的降低，我们发现高强度组松质骨发生了板状结构改变。另一方面，除了中等强度组内侧部分BMD 显著高于不运动组(p=0.004)，外侧部分Tb.N显著高于不运动组(p=0.021)以及低强度组内侧部分Tb.N显著高于不运动组(p=0.032)，低强度组和中等强度组均与不运动组无显著性差异。2.2 软骨下骨松质骨Microhardness结果显示：在胫骨软骨下骨松质骨外侧部位，HIR组的硬度值为48.26±4.24MPa，显著高于SED组45.42±2.61MPa(p=0.031)，LIR组和MIR组分别46.35±2.53MPa和45.14+3.21MPa，与SED组相比无显著性变化。在软骨下骨松质骨内侧部位，各组间均未出现显著性变化。2.3软骨下骨松质骨拉曼结果显示：高强度组内侧部分矿物质/基质显著低于不运动组(p=0.033),说明高强度组松质骨矿化程度较不运动组低。与不运动组相比，高强度组内侧部分碳酸盐/磷酸盐显著增高(p=0.002)，说明高强度组松质骨重塑增加。高强度组外侧和内侧部分矿物质结晶度都显著高于不运动组外侧(p=0.006)和内侧(p=0.002)部分。总的来说，与软骨下骨板类似，高强度组的结果表明相比于不运动组，其重塑和结晶度增加，而矿化程度降低。第一部分结论不同强度跑台运动对大鼠软骨下骨显微结构的影响具有强度依赖性:低强度和中强度的跑步运动对大鼠软骨下骨显微结构的影响不显著，高强度的跑步运动则显著改变软骨下骨的显微结构，这种改变被认为与我们前期研究证实的软骨下骨上覆盖的关节软骨退行性改变相关联。第二部分结论不同强度跑台运动对大鼠软骨下骨成分和力学特性的影响也具有强度依赖性。低强度和中强度跑步运动对软骨下骨成分和力学特性无明显影响，但高强度跑步运动导致软骨下骨成分改变，使其变得“硬化和易碎”，进而影响相邻软骨的健康。跑台运动 大鼠 软骨下骨 拉曼光谱 强度更多论文内容请下载PDF