3D打印和CAD/CAM氧化锆种植体骨结合性能的动物实验评价

钛种植体虽然因良好的“骨结合”［1］性能被广泛应用［2－3］，但也会因金属过敏或美学问题而被限制应用［4］。随着数字化技术与修复技术紧密结合，氧化锆种植修复有了技术突破［5－6］。本研究已建立氧化锆种植体的三维模型［7］，并制造3D打印氧化锆种植体和计算机辅助设计与制造(computer aided design ＆ computer assomated manufacture，CAD/CAM) 氧化锆种植体。 为了氧化锆种植体能够达到与BEGO钛种植体TiPurePlus 相当的表面粗糙度(粗糙度Ra= 1～2μm)［8－9］，预先对其表面进行喷砂和加热酸蚀处理。采用硬组织切片技术和反向转矩实验，比较两组氧化锆种植体与某公司纯钛种植体的成功率、骨结合率、种植体周骨密度和反向转矩值，评价氧化锆种植体骨结合性能［10］。 口腔医学 2021年2月 第41卷第2期·144· 倪王成，等.3D打印和 CAD/CAM氧化锆种植体骨结合性能的动物实验评价·145· 3D 打印和 CAD/CAM 氧化锆种植体骨结合性能的 动物实验评价 倪王成'，胡琳驰'，张维丹2，周贝贝，黄温棉，朱秦天，余季兰，王仁飞3 [摘要」 目的 比较 3D 打印和计算机辅助设计与制造( CAD/CAM)氧 化锆种植体与纯钛种植体在动物体内的 骨 结合和成骨 效果的差异，评价氧化锆种植体骨结合性能。方法 分别将3D 打印氧化锆、CAD/CAM种植体和钛种植体各20枚随机植入6只 Beagle 犬的胫骨内，8周后观察 氧 化锆种植体的成功率和骨结合能力，并与钛种植体进行比较，观察指标为种植体的成功 率、反向扭矩值、骨接触率和种植体周围骨密度。数据采用单因素方差分析( ANOV A ) 进行比较。结果 3组种植体的成功率 均为100%。CAD/CAM 氧 化锆种植体组的反向转矩值均大于 35 N · m； 3D 打印氧化锆种植体组的反向转矩值均大于35N·m；钛种植体组中2颗种植体的反向转矩值为20~35N·m，8颗种植体的反向转矩值大于35N·m。组织学观察：3D打印 氧化锆种植体、CAD/CAM 氧 化锆种植体和纯钛种植体的不含骨髓腔骨结合率分别为(66.35±6.64) %、(61.32±10.41)%和 (58.88±25.10)%，含骨髓腔骨结合率分别为(49.57±5.04)%(42.21±18.58)%和(38.45±23.27)%，平均骨结合率分别为 (58.94±6.31)%、(53.56±8.77)%和( 48.31±20.76)%，种植体周围骨密度分别为(60.59±7.31)%、(58.50±6.36)%和(58.18±14.80)%，差异无显著性(P>0.05)。结论 氧化锆种植体与纯钛种植体的骨结合能力相当，能形成紧密的直接骨接触，因此 氧化锆种植体有 望 成为口腔种植体的可选材料。 [关键词] 骨结合；氧化锆种植体；不脱钙种植体骨切片 [中图分类号] R782.1 [文献标识码」 A [文章编号 ] 1003-9872(2021)02-0144-05 |doi 10.13591/j .cnki.kqyx.2021.02.008 Animal experimental evaluation of bone-implant contact properties of 3D printed and CAD/CAM zirconia implants NI Wangcheng， HU Linchi， ZHANG Weidan， ZHOU Beibei， HUANG Wenmian ， ZHU Qintian， YU Jilan， WANG Renfei. ( School of Sto-matology Zhejiang Chinese Medical University School of Stomatology， Hangzhou 310053， China) Abstract： Objective To compare the osseointegration difference of 3D printed zirconia implants and computer aided design-computer assomated manufacture ( CAD/CAM) zirconia impl a nt s and pure ti t anium implant s in a nimals， and to evaluate the osteointe-gration performance of zirconia implants for zirconia implantation in bones. Methods Six Beagle dogs were selected， and randomly planted 20 3D printed zirconia i mplants， 20 CAD/CAM impl a nt s a nd 20 tit a nium i mpl a nt s i n tibias. Success rate and osteointegration performance of zirconia i mplants were evaluated 8 weeks later. Osseointegration performance was compared with t ita nium implants. The observational indicators of this study were success rate of the bone implant， reverse torque test， bone-to-impl a nt contact rate， and bone density around the implants . SPSS17.0 sof t ware was used for stati s tical an a lysis of the data. Results The success rates of the three groups of bone implants were a ll 100%. The reverse torque values of CAD/CAM zirconia i mpl a nt group were al l gre a ter than 35 N·m；the reverse torque values o f zirconia implant group with 3D printed technology were al l greater than 35 N · m； in the titanium i mplant group， the reverse torque value of two implants was between 20 and 35 N·m， and that of eight i mplant s was greater th a n 35 N·m.Hi s tological observation found that the rates of bone osseointegration without marrow cav it y of 3D printed zirconia implants， CAD/CAM zirconia impl a nts and pure t i t a nium implant s were (66.35±6.64)%，(61.32±10.41)% and (58.88±25.10) % respect i vely . The rates of bone osseointegration with marrow c a v i ty were ( 49.57±5.04)%，(42.21±18.58)% and (38.45±23.27) % respectively. The average rate of bone osseointegrat i on was (58.94±6.31)%， (53.56±8.77) % and (48.31±20.76) % respec ti vely. Moreover， the bone density around the i mplants was (60.59±7.31)%，(58.50±6.36) % and (58.18±14.80) % respec t ively. There was no significant difference af-ter data analy s is ( P>0.05) . Conclusion Zirconia implant s have similar osseointegration ability as pure titanium impl a nts ， and c a n form close direct bone contact. Therefore， zirconia implants may be an optional mate r ial for dental implants Key words： osseointegration； zirconia i mpl a nt ； undecalcified implant bone sec ti on Stomatology，2021，41(2)：144-148 基金项目：杭州市农业与社会发展科研计划(20172016A08) 作者单位：1浙江中医药大学口腔医学院，浙江杭州(310053)；2杭 州口腔医院种植中心，浙江杭州(310002)；3杭州口腔医院 VIP 中 心，浙江杭州(310002) 钛种植体虽然因良好的“骨结合”性能被广 泛应用12-31，但也会因金属过敏或美学问题而被限 制应用4。随着数字化技术与修复技术紧密结合，氧化锆种植修复有了技术突破15-61。本研究已建立 氧化锆种植体的 三 维模型 7，并制造 3D 打印氧化 锆种植体和计算机辅助设计与制造( computer aided design & computer assomated d manufacture， CAD/CAM)氧化锆种植体。 为了氧化锆种植体能够达到与 BEGO 钛种植体 TiPurePlus 相当的表面粗糙度(粗糙度Ra=1~2jum) 18-9]，预先对其表面进行喷砂和加热酸蚀处理。采用硬组织切片技术和反向转矩实验，比较两组氧 化锆种植体与某公司纯钛种植体的成功率、骨结合 率、种植体周骨密度和反向转矩值，评价氧化锆种植 体骨结合性能101。 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 主要仪器 Exakt510 脱水仪、Exakt520 光固 化包埋机、Exakt 300 CP 切片机、Exakt 400 CS 磨片 机(EXAKT公司，德国)，光学显微镜( Olympus公 司，日本)。 1.1.2 手术器械 NSK 种植机( NSK公司，日本)，种植器械盒( Thommen Medical AG，瑞士)，手术刀 柄，刀片，持针器骨膜剥离器，血管钳，组织剪，1号 丝线，巾钳，铺巾。 1.1.3 实验药物 速眠新(圣达动物药品有限公 司，中国)，3%戊巴比妥钠(科丰化学试剂有限公 司，中国)，注射用青霉素钠(华北制药股份有限公 司，中国)，多聚甲醛溶液、亚甲基蓝、酸性品红、高 锰酸钾、苦味酸、磷酸氢二钠(豪普斯生物技术有限 公司，中国)。 1.1.4 种植体 根据实验目的分为3组。实验组 1：经过表面处理的3D 打印氧化锆种植体20枚(昆 山博力迈三维打印科技有限公司)(图1A)；实验组 2：经过表面处理的 CAD/CAM 氧化锆种植体20枚 (杭州口腔医院)(图1B)；实验组3：某知名公司提 供纯钛超亲水种植体20枚(上海宇井贸易有限公 司)。所有种植体直径3.5 mm，长度8mm，穿龈2mm，基台高度4mm。 1.2 实验方法 1.2.1 两组氧化锆种植体植入前表面处理 3D 打 印氧化锆种植体和CAD/CAM氧化锆种植体植认前 采用颗粒尺寸为250 um 的Al0粒子，喷砂力度 0.8 MPa，距离18 mm，垂直喷砂4个循环，40%氢 氟 酸60℃酸蚀60 min，蒸馏水超声震荡干燥后采用扫 描电镜对 3D 打印氧化锆种植体和 CAD/CAM 氧化 A： 3D 打印；B： CAD/CAM 制作 图1 实验用一段式氧化锆植体 Fig.1 One-stage zirconia implant for experiment 锆种植体表面形貌进行显微观察。 1.2.2 实验动物及模型制作 实验动物成年雄性 健康的 Beagle 犬共6只，15个月龄，质量为16~17kg。实验动物使用许可证号： SYXK( 浙) 2018-0012。使用动物质量合格证明编号：201807863。动物种植 体植入手术及饲养均在浙江中医药大学动物实验中 心进行，所有实验动物在手术前均在笼子中隔离饲 养1周。 将60枚植体编号1~60号，按随机分配的原则 (随机数字表)植入6只 Be a gle 犬的胫骨中，每只 Beagle 犬每侧胫骨植人5枚种植体。全麻前准备：术前禁食12h；术前0.5h肌注青霉素钠80万U以 预防感染。种植手术：气管插管下，速眠新(0.04~0.08 mg/kg)对 Beagle 犬进行后腿肌肉注射。全麻 起效后，常规消毒铺巾，后腿阿替卡因 1.7 mL 浸润 麻醉，切开、翻瓣、暴露胫骨外侧，逐级预备种植窝，植入种植体，安放愈合帽。对位缝合创口，种植术后 即刻拍摄X线片，观察植入位置、角度(图2)。术后 常规抗感染处理。 图2 种植术后即刻拍摄X线片 Fig.2X-rays taken immediately after implantation 1.2.3 标本处理 在8周时，取3组种植体各10枚 进行反向扭矩测试，将扭力扳手与种植体垂直相接，缓慢拧出种植体，扭力扳手刻度显示将种植体拧松 的扭力值即为旋出扭力峰值。随后处死 Beagle 犬，将带有种植体的胫骨整段锯下(图3)，生理盐水反 复冲洗，固定后制备不脱钙硬组织切片。 1.2.4 不脱钙种植体骨切片的制备和染色 月 用4%的甲醛固定浸泡，4℃冰箱保存72h，然后用70%乙 图3 带有种植体的整段胫骨 Fig.3 Entire tibia with implants 醇溶液浸泡。修整带种植体的标本，标本大小约5mm×15 mm×10 mm，在 Exakt510 脱水仪中使用70%~100%的乙醇溶液梯度脱水，在 Exakt520 光固化包 埋机中进行树脂浸透包埋和聚合(图4)。完成聚合 反应后，准备A、B两张载玻片，用 Technov i t 4000粘 接剂把标本包埋块粘合于载玻片A上，将载玻片A 吸附于切片机夹具上，修整组织块，使用 Exakt 400CS 磨片机对标本表面进行抛光，然后用 Technov i t-7210VLC 胶水将载玻片B粘合于标本的抛光面侧，形成两侧载玻片、中间组织块的双夹结构。将载玻 片A 吸附在 Exakt 300 CPa 切片机夹具上，将切割 厚度设定为150~200 um，切下载玻片B侧约150um 厚的切片，使用 SiC 和 AlO，砂纸自动磨片，设 置厚度为 30 pm，再用细砂纸进行切片表面抛光，最 终制作出作厚度约为 30 pm 的光滑种植体骨磨片。将切磨好的骨切片使用双蒸水进行超声清洗10min，自然干燥后用亚甲基蓝-酸性品红染色，树脂 封片。 图4 树脂浸透包埋块 Fig.4 Resin impregnated embedded block 1.2.5 图像分析/光学观察及骨接触率测定 在光 学显微镜下观察并采集图像，结合图像处理软件 (Image-Pro Plus 6.0) 进行测量并根据骨接触率 ( bone-to-implant contact，BIC) 和种植体周围骨密度 ( bone density， BD) 公式计算，得到两组氧化锆种植 体和某知名公司纯钛组种植体的不含骨髓腔骨结合 率、含骨髓腔骨结合率、平均骨接触率和种植体周围 骨密度。骨接触率(不含骨髓腔)=骨皮质、骨松质 与种植体螺纹实际接触的长度之和/种植体螺纹植 入骨皮质、骨松质的长度×100%；骨接触率(含骨髓 腔)=骨髓腔与种植体螺纹实际接触的长度之和/种 植体螺纹植入骨髓腔内的长度×100%；平均骨接触 率=骨与种植体实际接触长度之和/种植体螺纹植 入骨组织内的长度×100%；种植体周围骨密度(BD)=骨结合区域/整个结合区域×100%Ⅱ，测量方法 为在螺纹端上放置一条切线，计算该切线与槽内种 植体轮廓之间的像素。 1.3 统计学处理 采用 SPSS17.0 软件包对所有实验数据处理。进行统计学处理后的数据以x±s 表示。数据采用单 因素方差分析( ANOVA) 进行比较，P<0.05表示差 异有显著性。 2 结 果 2.1 两组氧化锆种植体表面处理后扫描电镜观察 结果见图5~6，可见经喷砂+酸蚀后的氧化锆 表面形成均匀的粗化效果。3D 打印组表面大孔径 12~17 pm，小孔径1.1~2.6 um。经喷砂+酸蚀后的 CAD/CAM组表面大孔径 18~21 pm，小孔径1.0~2.6 um。 A： 表面大孔径为12~17 pm( ×1000)；B：小孔径为1.1~2.6 pm ×10 000) 图5 3D 打印种植体(实验组1)表面电镜观察 Fig.5 Surface electron microscopy of 3D printed implants ( Experimental group 1) A：表面大孔径为18~21 pm( x1000)；B：小孔径为1.0~2.6 um ×10 000) 图6 CAD/CAM种植体(实验组2)表面电镜观察 Fig.6 Surface electron microscopy of CAD/CAM implants (Experimental group 2) 2.2 影像学观察结果 术后离体的 Beagle 犬胫骨经便携式X线机拍 照，得到种植体植入的骨界面愈合情况(图7)。种 植体和周围骨组织嵌合紧密无间隙存在，螺纹均位 于骨平面以下，光滑面均位于胫骨骨皮质外，植体植 入方向 与 骨面垂直，植体之间的间距在2~3mm，植 体周围未见异常透射影像。三 组种植体的成功率均 为100%。 图7 种植体植入的骨界面愈合情况 Fig.7 Healing of bone interface after implantation 2.3 反向转矩值统计 3D 打印氧化锆种植体组及 CAD/CAM 氧化锆 种植体组的反向转矩值均大于35N·m；钛种植体 组中2颗为20~35 N·m，8颗大于35N·m。 2.4 亚甲基蓝-酸性品红染色、骨接触率测定 图8为种植体植入8周后，3D打印氧化锆种植 体、CAD/CAM氧化锆种植体和纯钛种植体的亚甲 基蓝酸性品红染色图。亚甲基蓝酸性品红染色可清 晰显示新旧骨组织边界和成骨细胞，便于区分软硬 组织。图中可看到紫红色的是骨小梁，蓝色的是间 质。新生的编织骨较疏松，染色较深紫色；密质骨为 浅紫色，骨小梁间的纤维网状结构为浅蓝色，纤维软 组织呈深蓝色，蓝色为类骨质。另外，位于螺纹表面 可以看到较粗的新生骨小梁。3组种植体不含骨髓 腔骨结合率、含骨髓腔骨结合率、平均骨接触率和种 植体周围骨密度数值如表1所示，差异均无显著性 (P>0.05)。 A ： 3D 打印氧化锆种植体 ； B： CAD/CAM 氧 化锆种植体 ；C：纯钛种植 体；密质骨、编 织骨、类 骨质、纤维软组织分别呈深紫色、浅 紫色、蓝 色、深蓝色；3D 打印种植体、CAD/CAM 氧 化锆种植体 、纯钛种植体 分别呈黄棕色、黑 色 图8 种植术后8周不脱钙种植体骨切片经亚甲基蓝 酸性品红染色的光学显微镜图像 Fig.8 Optical microscope image of the undecalcified implants stained with methylene blue acid fuchsin at the 8th week after implantation 表1 3组种植体骨结合率和种植体周骨密度 Tab.1 Rates of bone osseointegration and the bone density value of 3 implant groups X± 组别 BIC/% BD/% 不含骨髓腔 含骨髓腔 平均 3D 打印氧化锆 66.35±6.64 49.57±5.04 58.94±6.31 60.59±7.31 CAD/CAM 氧化锆 61.32±10.41 42.21±18.58 53.56±8.77 58.50±6.36 纯钛 58.88±25.10 38.45±23.27 48.31±20.76 58.18±14.80 P 0.579 0.363 0.231 0.846 F 0.557 1.054 1.547 0.168 3 讨 寸论 评价种植体骨结合性能的方法主要有影像学检 查、旋出扭力法、硬组织切片技术等。本研究选择 Beagle 犬作为实验动物模型来评价种植体的骨结合 性能，结合自身实验条件，选择X线牙片纵向观察 种植体骨界面愈合情况、种植体旋出扭矩、种植体骨 接触率、种植体周围骨密度等指标来比较3D 打印 氧化锆种植体、CAD/CAM 氧化锆种植体、纯钛种植 体的骨结合性能。 本实验采用X线片方法，观察种植体植认术后 8周的骨界面愈合情况，结果显示3组标本均未发 现种植体周围异常透射影像，植体植入的 三 维位置 与相互距离均正确，表明实验动物模型成功建立。 旋出扭力法属破坏性实验，会使种植体的骨结 合产生不可逆的损伤，所以临床应用受到限制。但 其仍是动物实验中评价骨结合程度的重要方法，一 般采用数字扭力测试仪测量并记录种植体骨结合被 破坏时的扭力峰值，间接评价骨结合的状况。Sullivan 等 12通过临床研究，将20N· m的扭力阀 值作为种植体骨结合成功的标准。本实验使用扭力 扳手测量旋出扭矩峰值，结果显示种植体植入术后 8周以后，3组种植体扭力峰值均大于20N·m，提 示各组种植体均能形成良好的骨结合，可认为是成 功骨结合的标准 [13 不脱钙种植体骨切片技术因其可以保存骨组织 的细微结构，已被广泛用于种植体骨结合的形态学 研究。主要的骨形态计 量 学参数有骨接触率和种植 体周围骨密度。骨接触率和种植体周围骨密度主要 反映种植体周围新骨形成的 量 ，这个 量 很难达到 100%14J。文献报道氧化锆种植体的 BIC 为27.1%~74%.0115-16，纯钛种植体的 BIC 为 23.2%~83.7%17-18]，一 般认为大于50%为适宜的骨结合 率1191。并且所有研究均显示，同 一 观察时间点氧化 锆种植体和钛种植体 BIC 差异无统计学意义。本研 究植入8周时的组织学结果显示，3组样本的平均 骨接触率均达到48%以上，种植体周围骨密度均在 58%以上，均可获得良好的初期稳定性，并且3组骨 接触率和种植体周围骨密度的差异无显著性。基于 本研究的结果可得出，3D 打印氧化锆种植体、CAD/CAM 氧化锆种植体和纯钛种植体可达到相似且良 好的骨结合程度，此结果和 Stenlund、王晓娜等的研 究结果 一 致120-21J 。 [参 考 文 献」 1 Branemark PI， Hansson BO， A de ll R， e t al. 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