Kjeltec 9 分析仪/蒸馏单元按照直接蒸馏法 DD使用蒸汽蒸馏测定氮含量

Kjeltec 9 分析仪/蒸馏单元按照直接蒸馏法 DD使用蒸汽蒸馏测定氮含量Application Note AN 5522Rev.1 KjeltecTM 9 分析仪/蒸馏单元 按照直接蒸馏法 [DD] 使用蒸汽蒸馏测定氮含 量 FOSS Kjeltec'M 9 解决方案 样品类型 Kjeltec 9 是 一 种自动的蒸馏单元，主要用于按照凯氏定氮法进行蛋 白分析的蒸馏过程，也可用于其他许多不同的蒸馏过程。选配内置 比色滴定和自动进样器可将凯氏定氮分析完全自动化。 本应用摘报中所述的方法包括下列 类别的样本： ● 小麦 FOSS Nils Foss Alle 1 DK-3400 Hi l lerod Denmark Tel ： +45 7010 3370 应用信息 此应用摘报应结合AN 55112]“依据凯氏定氮法进行氮的测定-总摘报”使用。 1.1 介绍 本应用摘报描述了 一 种使用 FOSS Kjeltec 蒸馏系统的直接蒸馏(DD)法测定氮的方法。感兴趣的样品 必须使用传统消化法(经典凯氏定氮法)和 DD 法进行检测。 样品：小麦样品12个(定标样品8个，验证样品4个)；样本来自 FOSS 在用的谷物网络。 本应用摘报可作为对其他样本类型执行 DD分析的指导。 1.2 原理 当 一 个固体样品在碱溶液中用蒸汽进行蒸馏时，蛋白中的某些氮会转化成氨。氨会被释放并由接收 液收集，然后通过滴定测定。氮的释放不是定量的，很大程度上取决于样品类型和样品处理所采用 的技术。 为了得到精确的分析结果，对于每 一 种类型的产品，直接蒸馏法都必须按照传统的凯氏定氮方法进 行校正 。 由于直接蒸馏法不包括酸消化的步骤，相比完整的消化步骤来说更快更环保。 当要求速度或要分析很多同一类型的样品时，采用这种方法很有效。 该方法测定从尿素、氨基酸和蛋白质以及其他容易释放的氮源中的氨和氮。 1.3 安全防范 凯氏定氮法需要在高温下使用强酸来消化样品，必须要小心的操作试剂来保证安全。对于试剂的操 作可以参考有关的 MSDS。 另外，酸消化操作需要在通风良好的通风橱中进行 ，任何操作都需要配戴护目镜，处理热的消化管 时也要加以注意。分析过程中产生的所有废物必须按照当地的要求和法规进行处理。 遵守仪器用户手册和 MSDS 中的安全说明。 Fig.7 个人防护设备 1.4 设备 A.研磨或粉碎设备，如 FOSS CT 293 CyclotecTM B.分析天平，精确到0.1g C. 消化装置，如 DT208， DT220， Digestor 2508或 Digestor2520 D. 蒸馏、滴定和自动进样器 月 用于蒸汽蒸馏： Kjeltec 9 蒸馏单元 用于蒸汽蒸馏和自动滴定： Kjeltec 9分析仪 ● 自动进样器： Kjeltec 9 自动进样器包括20位或60位，可以和 Kjeltec 9分析仪联用 E. 250 ml 消化管 F. 滴定管，50ml 或同等设备-用于手动滴定 G.锥形瓶(接收液瓶， 500ml)-用于手动滴定 H.移液管 1.5 试剂 在分析中，使用分级纯以上级别的试剂。 有关试剂制备的进一步信息，请参考 AN 5511。 A. 98%硫酸 B.催化剂片： Kjeltab Cu 3.5 (3.5 g K2SO4 +0.4 g CuSO45H2O) C.消泡剂(可选项) D. 40% w/v氢氧化钠(NaOH)溶液 E. 滴定剂(标准溶液) (0.1±0.0001) mol/l 盐酸标准溶液-浓度取决于氮含量， 见 AN 5511 F. 接收液 ● 1%硼酸和溴甲酚绿/甲基红混合溶液-用于自动滴定 4%硼酸和溴甲酚绿/甲基红混合溶液-用于手动滴定 注释：当使用0.1N盐酸时，推荐接收液的空白值介于0.05至0.15ml 之间。 1.6 分析细节 本应用摘报中，分析了12个小麦样品。使用8个样本创建标准曲线，选取4个样本作为验证样本。用 Kjeltec 9 仪器对每个小麦样品进行了十个重复分析。使用 Kjeltec 8000 系列对每个小麦样品进行 了 三 个重复分析以进行比较。 用标准曲线估算4个验证样品的蛋白质含量。 1.6.1 样品准备 应仔细考虑 DD 分析的样品制备程序，以免造成最终实验结果的错误。获得能够代表大批量产品的分 析样品的程序 差 别很大。一 旦建立了 DD 的样品制备方法，必须固定下来，以确保校准样品和验证样 品之间的相关性。 从大样品采得的实验室样品中获得分析试样可能要进行 一 种或多种样品处理以使样品均质。方法可 以有简单的物理处理如振荡、搅拌、研磨、等格缩分、四分法采样 等 ，或是机械处理如研混、均质 或粉碎。根据样品不同(混合物、复合物或单 一 组分)使用不同的处理方法。 样品 一 般可分为：固体、半固体或糊状、液体。 固体样品 固体样品 一 般用粉碎的方法处理。用直接蒸馏法进行测定的样品必须用合适的实验室粉碎磨以得到 很细的粒度，例如可以用 FOSS 的旋风磨 。处理方法的一致性是获得理想实验结果的重要条件，特别 是实验中的一系列条件已经确定时更是如此。 例如：用旋风磨磨出的很细的样品颗粒将增加直接蒸馏法的功效，如果与用 Cemotec 粉碎机处理的 同 一 样品在同一条件下分析，结果是没有可比性的，因为Cemotec 处理的样品氮的释放效果很差。 半固体样品 此类样品是最难处理的，尤其是样品粒度范围较宽和/或某些组分比较坚硬时更难处理。根据体的 样品类型可用匀浆、液化或球磨的方法处理以获得适 当 的分析样品。很多情况下，简单的乳钵和研 钵就可以很好处理样品了。和所有的样品制备 一 样，为了达到合乎要求的样品均匀度，或许需要两 种或多种处理方法并用。 液体样品 液体样品可有两种基本形式，即只含有可溶性物质的液体和含有颗粒的液体或悬浊液如牛奶。前者 只需要震荡或搅拌就可直接取样。 另 一 方面，悬浮液可能需要不同的处理，这取决于悬浮液的哪个相是感兴趣的，或是否样品的整个 部分是感兴趣的。例如，未均质的牛奶在 静 置时会分离成含有悬浮固体的水相和浮在表面的脂肪相 (奶油)。 无论分析哪种样品类型，除非在分析前进行了令人满意的样品制备，否则会引入显著的误差。 样品称重 对于凯氏定氮分析，应使用精确到0.1 mg 的分析天平定 量 地称量样品。 所需样品的实际重量取决于氮含量和均匀性 。一 般来说， DD 方法比传统的凯氏定氮法需要更多的样 品量，因为氮的回收率较低。 为了获得 DD 的准确结果，用于分析的样品量和前处理必须是相同的标准。 每种样品类型使用的样品 量 需要进行验证。 用于定标的样品数量 为建立 DD 样品的标准曲线，应至少收集12个样本，覆盖预期的蛋白质变化和产品品种范围。12个 样品中的每 一 个都必须经过相同的样品前处理程序。必须进行至少子样品数为24的平行样分析，以 避免样品含水量的变化或其他变化。 如果重复样品的 DD 测量差异超过 0.2 mL 滴定剂(0.1N)，该样品应重测。 1.6.2 样品信息-传统凯氏定氮 样品类型 样品量 重复测试个数 测试仪器 12个均质的小麦样品 1g n=10 Kjeltec 9分析仪 12个均质的小麦样品 1g n=3 Kjeltec 8400 分析仪 Table 1 Kjeltec 9 分析仪分析了120个样品，用于丫轴； Kjeltec 8400 分析仪分析了36个样品，用于Y轴，见1.8.3章节 1.6.3 样品信息-直接蒸馏分析， Kjeltec 9 蒸馏单元 样品类型 样品量 重复测试个数 测试仪器 12个均质的小麦样品 1g n=10 Kjeltec 9 蒸馏单元 12个均质的小麦样品 1g n=3 Kjeltec 8200 蒸馏单元 Table 2 Kjeltec 9 蒸馏单元分析了120个样品，用于X轴； Kjeltec 8200 蒸馏单元分析了36个样 品，用于X轴；见1.8.3章节 1.6.4 样品信息-直接蒸馏分析， Kjeltec 9分析仪 样品类型 样品量 重复测试个数 测试仪器 12个均质的小麦样品 1g n=10 Kjeltec 9分析仪 12个均质的小麦样品 1g n=3 Kjeltec 8400 分析仪 Table 3 Kjeltec 9 分析仪分析了120个样品，用于X轴；；Kjeltec 8400 分析仪分析了36个样品，用于X轴；见1.8.3章节 1.6.5 空白测定 化学空白应在每批分析之前运行，以补偿所使用试剂的任何贡献。建议空白样品的数量为每批3个。经典的凯氏定氮法和 DD分析都需要进行空白测定。 1.6.6 消化程序-传统凯氏定氮 样品类型 样品量 重复次数 H2SO4 Kjeltab Cu 3.5 消泡剂 消化温度 消化时间 固体 1g n=10 12ml 2 pcs 2 pcs 420°C 60 min Table 4 传统凯氏定氮的消化程序设置 1.6.7 蒸馏程序-传统凯氏定氮 型号 稀释水 碱液 Delay/SAfE 接收液 蒸馏终点 蒸汽功率 试管排空 Kjeltec 9 蒸馏单元 80 ml 50 ml 5 s / SAfE 30 ml 4%硼酸 时间：4min 100% 是 Kjeltec 9分析仪 80 ml 50 ml 5 s / SAfE 30 ml 1%硼酸 自动 100% 是 Table 5 传统凯氏定氮的蒸馏程序设置 1.6.8 蒸馏程序·DD 型号 稀释水 碱液 Delay/SAfE 接收液 蒸馏终点 蒸汽功率 试管排空 Kjeltec 9 蒸馏单元 30 ml 70 ml 5 s / SAfE 30 ml 4%硼酸 时间：4min 100% 否 Kjeltec 9分析仪 30 ml 70ml 5 s / SAfE 30 ml 1%硼酸 自动 100% 否 Table 6 直接蒸馏法的蒸馏程序设置 步骤 制备具有代表性的均质样品，称量样品加入蒸馏管，每克样品重量偏差在2mg以内 。 2.样品预处理和样品量必须与经典凯氏定氮分析相同。 3.样品量可以按样品预期的氮含量进行调整，参见 AN 5511。 注释：对于用经典凯氏定氮法消化的样品，称量纸可以加入消化管中。对于 DD样品，称量纸 不能加入到蒸馏管中，因为这会给蒸馏过程带来问题 4. 在蒸馏单元和分析仪中创建一个程序，可参考 Table 1-6中的描述。 5. 蒸馏单元：需要将一个包含 30mL 接收液(4%硼酸)的锥形瓶放入蒸馏器单元；确保馏出液出口 浸入到接收液中。 6. 将蒸馏管放入蒸馏单元或分析仪中，并启动程序。 7. 蒸馏单元：用标准盐酸(通常为 0.1000 N 或 0.2000 N) 滴定馏出液，直到达到终点颜色。记录 滴定所消耗的滴定液的体积(mL)。 1.8 标准曲线和结果表达 1.8.1 标准曲线 对于每种样品类型，必须创建 一 个 DD 结果(x轴)与凯氏定氮结果(y轴)的标准曲线。—一 旦建立了这个 标准曲线，它就可以用于日常样品检测，只需要定期与经典凯氏定氮法比较检查准确性即可。进行 DD 检测时，对同一组样品至少进行2个重复测定，避免样品水分含量变化或其他变化。 计算重复测试的平均结果，并和传统凯氏定氮法的结果绘制回归图， 如 Fig. 2 所示。 Fig.2 从图中可以求出两个常数a和b的值。这些常数用于直接从 DD 读数计算凯氏定氮的蛋白含 量 ： 另一种方法是用计算器建立一个线性回归方程。然而，图形的可视化表示更容易评估包括校准中的 样本的任何奇怪偏差。 一 般来说，凯氏定氮蛋白与 DD 之间的相关性为r>0.95。 1.8.2 计算 按下式结算蛋白质的含量： a=截距(从标准曲线获得) b=斜率(从标准曲线获得) Samplemi=在 DD 测定中滴定样品消耗的滴定剂体积， ml Bnlakmi=在 DD 测定中滴定空白消耗的滴定剂体积， ml 1.8.3 方法性能 该研究是 FOSS 使用模块消化炉、Kjeltec 9 自动蒸馏装置和自动滴定器以及 Kjeltec 9分析仪进行 的，使用的是本应用摘报和 AN 5511 描述的程序 。作为参考，也用 Kjeltec 8200 和8400在同等条件 下进行了测试，以进行比较。 选择了12个不同的小麦来检验这四种仪器的性能。其中8个小麦样品用于创建 DD标准曲线，另外 4个小麦样品作为验证样品。 Kjeltec 9 蒸馏单元和分析仪的结果 Table 7 Kjeltec 9 蒸馏单元和分析仪的 DD 结果，， n=120。每个校准点和验证点是10个子样品的 平均结果。 X轴为使用的滴定液的体积，两种仪器都用最后 一 个空白进行修正(见1.6.3和1.6.4)。Y轴是传 统凯氏定氮法得到的蛋白质含量(%) (见1.6.2)。 两种仪器凯氏定氮法的蛋白质和 DD结果的相关性都高于0.95。 Kjeltec 8200 蒸馏单元和 Kjeltec 8400 分析仪的结果 Table 8 Kjeltec 8200 蒸馏单元和Kjeltec 8400 分析仪的DD 结果， n=36。每个校准点和验证点 是3个子样品的平均结果。 X轴为使用的滴定液的体积，两种仪器都用最后 一 个空白进行修正(见1.6.3和1.6.4)。Y轴是传 统凯氏定氮法得到的蛋白质含 量 (%) (见1.6.2)。 两种仪器凯氏定氮法的蛋白质和 DD结果的相关性都高于0.95。 1.9 参考方法 [1] FOSS 应用摘报 AN 5511 2 问题和反馈 如果您对这个应用简报有任何问题或反馈，请联系 FOSS 的支持团队。 Jacob Strange Ebbesen Product Specialist， Service 3 版本历史 版本 发布日期 修改内容 批准 1 2022-06-14 首发 JSE