利用 Fossomatic 7 DC 确定体细胞分型计数——创新参数

利用Fossomatic 7 DC 确定体细胞分型计数——创新参数 作者：Daniel Schwarz 博士，丹麦福斯公司牛病专家 Dedicated Analytical Solutions 体细胞计数(SCC)表示牛奶中的细胞总数量，是全世界范围内用来检测和管理奶牛群乳腺炎的重要指标。尽管奶牛的乳房健康情况在过去40年里已经有了显著改善(例如Sampimon et al.， 2005)，但乳腺炎仍然给乳品业造成巨大经济损失(例如 Seegerset al.，2003)。困难在于乳腺炎是一种非常复杂的疾病，受多种因素的影响，例如环境和奶牛饲养。另外，乳腺炎的病原体不断进化，这就需要改变乳腺炎管理方案。此外，奶牛也在发生变化，产奶量明显增多，这就需要采取不同类型的奶牛管理方法。 考虑到牛奶中体细胞主要包含淋巴细胞、巨噬细胞和多形核中性白细胞(PMN)，研究人员发现除了确定总的体细胞数以外，细胞的分型有利于更准确地体现奶牛乳房的实际健康状况 (Pillai et al.， 2001； Rivas et al.， 2001； Pilla et al.， 2013)。牛奶中的这三种主要细胞群对奶牛乳腺中的炎症反应起到重要作用 (Sordillo et al.， 1997；Oviedo-Boyso et al.， 2007)。简单来说，淋巴细胞负责调节感应和抑制免疫应答。巨噬细胞能识别侵入的乳腺炎病原体，通过产生大量PMN，发起免疫应答。此外，巨噬细胞能吞噬细菌、细胞碎屑和积累的牛乳成分，并执行组织修复。PMN 细胞在乳腺炎初期负责抵御入侵的细菌。 乳腺炎期间，总的体细胞计数以及细胞的组成都会明显变化。在健康乳腺产出的牛奶中，体细胞计数较低，其中主要包含巨噬细胞和淋巴细胞 (Lee et al.， 1980； Schwarzet al.， 2011a， b； Pilla et al.， 2012)。发生感染时，体细胞计数会显著增加，而且PMN成为占多数的牛奶体细胞 (Paape et al.， 2002)。 福斯新技术的关键要素 福斯已研发一种获得了专利的最新方法，用以同时确定体细胞计数和新参数——体细胞数分型计数(DSCC)。全新 Fossomatic 7 DC 可确定这两种参数，测量能力可达每小时600个样品。因此，当前 Fossomatic 型号的基本测量原理得到了再设计和扩展。所以，用来测量 SCC 和 DSCC 的新型 Fossomatic 仪器的关键要素是：全新化学过程，全新培育装置，以及全新测量模块。 全新化学过程基于荧光染料吖染橙 (Fossomatic DC 染料)。牛奶细胞的特性在文献中已有详细介绍(例如Lee et al.，1980)，并在添加吖啶橙时利用这些特性，因为细胞核以及细胞区室都要染色。 为设备增加全新培育装置，以确保利用 Fossomatic DC 试剂对细胞进行恰当的和标准化培育。每个样品需严格在40℃的培育装置内停留一分钟。 全新测量模块是 Fossomatic 7 DC 的核心。使用耐久的 LED 激光作为光源，利用三个检测器，接收通过激光的每个细胞的荧光和形态信息。在两个荧光通道，即FL1和FL2中测量荧光信号。用侧向散射(SSC)检测器捕捉每个细胞的形态特性，尤其是粒度。 上述关键要素结合，使 Fossomatic 7 DC 能同时测量 SCC 和DSCC， 过程如下：分析固定体积的牛奶样品，以计算每毫升牛奶的细胞数量。在 FL1 vs. FL2点车图(图1A)中识别体细胞，并与牛奶背景(例如细菌、脂肪球等)分开。此外，在背景中使用 SSC信息以更准确地确定 SCC。在采用不同比例的第二个 FL1 vs. FL2 点阵图中，进一步步究图1A中识别的体细胞，以将巨噬细胞与淋巴细胞和 PMN组进行行分(图1B).DSCC 参数表示淋巴细胞和 PMN组的百分比。巨噬细胞的百分比是100-DSCC。 FL1 FL1 图1.新型 Fossomatic 7 DC的测量原理图。A：背景(灰色点)与牛奶细胞(深蓝点)荧光信息的分离，以及SCC 的确定(橘色方框)。B：只使用图1A中的体细胞细定 DSCC， 将巨噬细胞(灰色点)与淋巴细胞和 PMN ((橘色点)进行区分。FL=荧光发射 新方法的性能 当前针对 DHI 样品的新开发方法，是为了满足特异性、精确性、可靠性、重复性、稳健性方面的高要求，并提高样本处理量。 在没有 DSCC参考方法的情况下，福斯利用荧光显微法开发一种内部参考方法。采用DSCC 法在式式细胞分析仪和荧光显微镜上分析113个常规DHI样品，将 DSCC结果比较之后得到 r= 0.8391 的高相关系数(图2)。 100 图2.利用福斯 DSCC 法在流式细胞分析仪和荧光显微镜上分析113个常规DHI样本之后得到的 DSCC结果。 n=113 r=0.8391 下一步，对常规 DHI样品进行细胞分选试验，以测试新方法的精度。分别以两个不同的组(图1B)分选体细胞，然后使用荧光显微镜法进行区分。经过显微镜观察确定，DSCC区域(橘色点，图1B)中83%的细胞都是淋巴细胞或 PMN。 以上实验均证明了细胞的正确区分；为证明 SCC 的测定正确性，需要使用最新的福斯DSCC 法和 Fossomatic FC 测量640个常规DHI样品，并比较 SCC结果。实验表明，牛奶中所有细胞都被正确染色和测定(图3，r=0.9937)。 为测试该方法的重复性，需要分析常规的牛奶混合样本，并且分为了五组执行，发现其拥有良好的重复性(标准偏差2%)。 针对多种样品因素测试该方法的稳健性。为获得可靠的 DSCC数值，牛奶样品的时间不能超过四天。测试过程中使用溴硝丙二醇作为防腐剂。不过，在使用叠氮化钠保存的样品中发现 DSCC 的稳定性有所降低。 由于每个样本只测试50微升的牛奶，用来确定 DSCC 的细胞数量显然取决于 SCC。为获得充分的输出统计量 (SCC 和 DSCC)，则将该方法的性能范围设定为50，000至1，500，000个细胞/ml. 结论， 新型 Fossomatic 7 DC 是首款能同时对 SCC 和 DSCC 两种参数进行标准化常规分析的仪器，并且能以低成本对未经处理的单个牛奶样品(即DHI样本)进行标准化常规分析。这款新型仪器能对 SCC 和 DSCC 实现具体、可靠和可重复的测定，速度达到600个样品/小时。除了已有的 SCC 指标， DSCC 能指出牛奶中的 PMN 和淋巴细胞组合占比。这样能更详细体现乳腺的实际炎症状态。同理，这也为新工具开发提供了机会，以便加强对乳腺炎的管理。 获取更多信息： das@foss.dk References Lee， C.S.， F.B.P. Wooding， and P. Kemp. 1980. Identification properties and differentialcounts of cell populations using electron microscopy of dry cows secretions， colostrumand milk from normal cows. J. Dairy Res. 47：39-50. Oviedo-Boyso， J.， J.J. Valdez-Alarcon， M. Cajero-Juarez， A. Ochoa-Zarzosa， J.E. Lopez-Meza，A. Bravo-Patino， and V.M. Baizabal-Aguirre. 2007. Innate immune responseof bovine mammary gland to pathogenic bacteria responsible for mastitis. J. Infect.54：399-409. Paape， M.J.， J. Mehrzad，X. Zhao， J. Detilleux， and C. Burvenich. 2002. Defense of thebovine mammary gland by polymorphonuclear neutrophil leukocytes. J. Mammary GlandBiol. Neoplasia.7：109-121. Pilla， R.， M. Malvisi， G. Snel， D. Schwarz， S. Konig， C.-P. Czerny， and R. Piccinini. 2013.Differential Cell Count as an alternative method to diagnose dairy cow mastitis. J. DairySci. 96：1653-1660. Pilla， R.， D. Schwarz，S. Konig， and R. Piccinini.2012. Microscopic differential cell countingto identify inflammatory reactions in dairy cow quarter milk samples. J. Dairy Sci. 95：4410-4420. Pillai， S.R.， E. Kunze， L.M. Sordillo， and B.M. Jayarao. 2001. Application of differentialinflammatory cell count as a tool to monitor udder health. J. Dairy Sci. 84：1413-1420. Rivas， A.L.， F.W. Quimby， J. Blue， and O. Coksaygan. 2001. Longitudinal evaluation ofbovine mammary gland health status by somatic cell counting， flow cytometry， andcytology.J.Vet. Diagn. Invest. 13：399-407. Sampimon， O.， J. Sol， and P. Kock. 2005. Changes in bulk milk somatic cell count anddistribution of mastitis pathogens over the past 50 years in the Netherlands. In Proceedingsof the 4th IDF international Mastitis Conference. Maastricht， The Netherlands.963-968. Schwarz， D.， U.S. Diesterbeck， S. Konig， K. Brugemann， K. Schlez， M. Zschock， W. Wolter，and C.-P. Czerny. 2011a. Flow cytometric differential cell counts in milk for the evaluationof inflammatory reactions in clinically healthy and subclinically infected bovine mammaryglands. J. Dairy Sci. 94：5033-5044. Schwarz， D，U.S. Diesterbeck， S. Konig， K. Brugemann， K. Schlez， M. Zschock， W. Wolter，and C.-P.Czerny. 2011b. Microscopic differential cell counts in milk for the evaluation ofinflammatory reactions in clinically healthy and subclinically infected bovine mammaryglands. J. Dairy Res. 78：448-455. Seegers， H.， C. Fourichon， and F. Beaudeau.2003. Production effects related to mastitisand mastitis economics in dairy cattle herds. Vet. Res. 34：475-491. Sordillo， L.M.， K. Shafer-Weaver， and D. DeRosa. 1997. Immunobiology of the mammarygland. J. Dairy Sci. 80：1851-1865. FOSS 福斯 Foss Alle 1 DK-3400 Hilleroed 丹麦 电话：+4570103370 传真：+45 7010 3371 info@foss.dk www.foss.dk 第页 第页 体细胞计数(SCC)表示牛奶中的细胞总数量，是全世界范围内用来检测和管理奶牛群乳腺炎的重要指标。尽管奶牛的乳房健康情况在过去 40 年里已经有了显著改善，但乳腺炎仍然给乳品业造成巨大经济损失。困难在于乳腺炎是一种非常复杂的疾病，受多种因素的影响，例如环境和奶牛饲养。另外，乳腺炎的病原体不断进化，这就需要改变乳腺炎管理方案。此外，奶牛也在发生变化，产奶量明显增多，这就需要采取不同类型的奶牛管理方法。考虑到牛奶中体细胞主要包含淋巴细胞、巨噬细胞和多形核中性白细胞(PMN)，研究人员发现除了确定总的体细胞数以外，细胞的分型有利于更准确地体现奶牛乳房的实际健康状况。牛奶中的这三种主要细胞群对奶牛乳腺中的炎症反应起到重要作用。简单来说，淋巴细胞负责调节感应和抑制免疫应答。巨噬细胞能识别侵入的乳腺炎病原体，通过产生大量PMN，发起免疫应答。此外，巨噬细胞能吞噬细菌、细胞碎屑和积累的牛乳成分，并执行组织修复。PMN 细胞在乳腺炎初期负责抵御入侵的细菌。福斯已研发一种获得了专利的最新方法，用以同时确定体细胞计数和新参数——体细胞数分型计数(DSCC)。全新 Fossomatic 7 DC 可确定这两种参数，测量能力可达每小时 600 个样品。因此，当前 Fossomatic 型号的基本测量原理得到了再设计和扩展。