DLS 方法开发和验证（上）

1.  引言虽然 DLS 在制药行业广泛使用，但关于方法开发和验证主题的文章很少。提及 DLS 的药典测试是 USP<729>脂质注射乳剂中的球体大小分布。1 因此，本文提供了有关在制药行业中使用 DLS 的一些见解。 2.  USP<729>此标准要求使用 100、250 和 400 nm 三个尺寸规格的 PSL 标准粒子来验证 DLS 系统。本文作者不理解为什么选择这些粒径，尤其是合格/不合格的标准是 500 nm。许多使用DLS 的专家认为，仅以一种粒径进行测试应该即可验证系统是否正常运行。对这些标准进行3次测量，强度加权平均粒径和标准偏差应与预期值在可接受的误差范围内一致。而可接受的度是根据“在可接受的误差范围内”给出的。也许平均粒径在 ±10% 的范围内是合理的。 系统适用性部分指出，如果 CV 不超过 10%，则分析标准品时的重现性符合标准。通过 USP<729>测试要求强度平均粒径小于 500 nm (0.5 µm) 并且卡方值 (x2) 保持“可接受的低”。Nicomp® 用户手册指出，良好的高斯结果的卡方值低于2 - 3。因此卡方值<3 表示通过结果。 3.  质量标准说明因为USP<729>测试是使用 DLS 的药典专著，其质量标准设定值得考虑，但药典质量标准不一定适合所有药物。一种更常见的规范方法是定义强度平均值的值和范围以及与分布宽度相关的一些计算。DLS 的 ISO 标准建议关注强度平均值和多分散性指数(PI)。2 作者看到的一些 DLS 规格包括 D10、D50 和 D90 的值。这些值可能来自制药行业广泛使用激光衍射进行粒度分析。USP<429>测试光衍射测量粒径3经常使用 D10、D50 和 D90。设置质量标准的另一种方法是从USP<429>中借鉴重现性相关内容， USP<429>中“重复”部分给出的基于体积分布的重现性范围为： ● D50 = 10% ● D10, D90 = 15% ● 在 10 µm 以下，这些最大值可以加倍 遵循这些指南的内容，DLS 规格（根据定义尺寸小于 10 µm）对于强度平均值可以是可重复的 ±20%，对于 PI 或其他计算结果指示分布宽度是可重复的 ±30%。对于某些药品，这可能是一个可以接受的范围，但要注意当粒径非常小时出现的统计问题。如果平均粒径为 500 nm，±20%，则范围为 400 – 600 nm，这还不错。但对于平均粒径为 10 nm 的蛋白质，范围则为 8-12 nm，这样的粒径跨度变得非常挑战且难以接受。 4.  分析方法开发在开发方法之前，需要调查样品制备问题。这可以从简单的（将样品移入比色皿中）到复杂的（用表面活性剂和超声波分散）。样品制备的主题超出了本文档的范围，但已在之前的技术说明中讨论过。4 使用 DLS 制备样品进行分析时需要考虑的一些建议包括：—— 测试浓度的影响。测量、稀释并再次测量。 —— 测试测量时间的影响。测量 3、5 和 10 分钟。 —— 确保任何稀释剂都经过充分过滤。WFI 可能不够干净。 —— 确保使用样品池都足够干净。—— 是否应使用过滤器去除样品中的大颗粒？ —— 哪个样品池合适。 —— 调查任何可能影响结果的仪器设置。 优化样品制备步骤和仪器设置后，就可进行测试重复性实验。调查分析时间的微小变化是否对结果有任何重大影响。如果该方法需要 5 分钟的分析时间，则在 4 分 30 秒和 5 分 30 秒时测试。检查结果是否相同。 一旦方法得到优化，下一步就是按照标准 FDA 指南记录该方法。5 目标是足够详细地描述程序，以便其他操作员可以执行相同的测试并生成相同的结果。列出了必须包含的基本信息： —— 原理/范围：分析测试/技术的基本原理。 —— 装置/设备：仪器类型、激光、检测器、检测角度和样品池类型。—— 操作参数：温度、粘度、分析时间和通道宽度。 —— 试剂/标准品：用于验证性能的聚苯乙希乳胶 (PSL)。PSS 建议使用 90 nm PSL（请参阅 Entegris 技术说明 - 系统验证）。—— 标准控制溶液制备：稀释剂，稀释。6  —— 程序：程序的逐步描述。将准备好的样品放入比色皿中，放入到系统中，定义参数并进行测量。 —— 系统适用性：测试以确保系统在使用时能够正常运行。6 —— 计算：所有结果计算通常直接在DLS 系统操作系统软件中进行。8 可以在电子表格中进行额外的统计计算。 —— 数据报告：数字数据、格式、有效数字的表示。Entegris 建议将结果重点放在光强强度加权平均直径上。5.  关于参考标准和材料的说明如上所述，我们认为单个粒径的测试足以验证系统是否正常运行。多家供应商提供多种粒径标准品，客户可以选择他们推荐使用的样品。但Entegris对两种 PSL 标准粒子拥有丰富经验，这些也是我们通常建议客户用来验证其 Nicomp6 的样本。Thermo Fisher 3000 系列 NIST 可溯源 90 nm 标称 PSL 标准通常用于验证 Nicomp 性能。样品的目录号为 3090A，认证值为 92 ± 3 nm。另一个经常使用的样品是 Thermo Fisher 目录号 5009A，值为 90 nm。该样品不可追溯到 NIST，但我们有足够的经验推荐使用该样品，而且它比 3000 系列产品便宜。 注：DLS 是一种不需要校准的第一原理技术。该系统使用一种或多种 PSL 标准进行验证。如果系统未通过验证步骤，则无法进行调整以使结果进入预期范围。验证结果失败可能是由于系统工作不正常而需要维修，或者更常见的是标准粒子准备不当，应在尝试另一次测量之前重新准备。 6.  仪器介绍参考资料1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation 5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 20156 Entegris Technical Note, DLS System Verification 7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website. 8 Entegris Technical Note, DLS Data InterpretationDLS 方法开发和验证 Nicomp@ DLS 系统 动态光散射 (DLS) 正在成为制药行业中越来越流行的亚微米级药品粒度分析技术。本技术 说明试图为使用此技术进行方法开发和验证放行测试的客户提供指导。 引言 虽然 DLS 在制药行业广泛使用，但关于方法开发和/或验证主题的文章很少。唯一提及 DLS 的药典测试是 USP <729>，脂质注射乳剂中的球体大小分布。!因此，本文提供了有 关在制药行业中使用 DLS 的一些见解。 USP <729> 此标准要求使用100、250和 400 nm 三 个尺寸规格的 PSL 标准粒子来验证 DLS 系统。本文作者不理解如何/为什么选择这些粒径，尤其是合格/不合格的标准是500 nm。许多使 用 DLS 的专家认为，仅以一种粒径进行测试应该即可验证系统是否正常运行。对这些标准 进行3次测量，强度加权平均直径和标准偏差应与预期值在可接受的误差范围内 一 致。而科 接受的度是根据“在可接受的误差范围内”给出的。也许平均直径在 +/-10%的范围内是合 理的。系统适用性部分指出，如果 CV 不超过10%，则分析标准品时的重现性符合标准。通过 USP <729>测试要求强度平均直径小于 500 nm (0.5 um) 并且卡方(x²)参数保持“可 接受的低”。 NicompQ 用户手册指出，良好的高斯结果的卡方值低于2-3。因此卡方值<3表示通过结果。 质量标准说明 因为 USP <729> 测试是唯 一 使用 DLS 的药典专著，其质量标准设定值得考虑，但药典质 量标准不一定是所有药物。一 种更常见的规范方法是定义强度平均值的值和范围以及与分布 宽度相关的一些计算 。 DLS2 的 ISO 标准建议关注强度平均值和多分散性指数(PI)。作者 看到的一些 DLS 规格包括 D10、D50和 D90 的值 。这些值可能来自制药行业广泛使用 激光衍射进行粒度分析。 USP <429> 测试光衍射测量粒径3经常使用 D10、D50和 D90。设置质量标准的另 一 种方法是从USP<429>中借鉴重现性相关内容， USP <429> 中“重复”部分给出的基于体积分布的重现性范围为： ·D50=10% ·D10，D90=15% ·在 10 um 以下，这些最大值可以加倍 遵循这些指南的内容， DLS 规格(根据定义尺寸小于 10um)对于强度平均值可以是可重 复的±20%，对于PI 或其他计算结果指示分布宽度是可重复的±30%。对于某些药品，这可能是一个可以接受的范围，但要注意当粒径非常小时出现的统计问题。如果平均粒径为 500 nm，±20%，则范围为400)-- 600nm， 这还不错。但对于平均粒径为10nm 的蛋白 质，范围则为 8-12 nm， 这样的粒径跨度变得非常挑战且难以接受。 虽然乍一看将 D10、D50 和 D90 方法从激光衍射转移到 DLS 似乎是合理的，但请记住，DLS 的主要计算结果是基于光强粒径分布，而不是体积粒径分布。从光强到体积分布的转 换涉及特定于仪器制造的计算，并且尚未通过 ISO 文档进行协调。 方法开 发 在开发方法之前，需要调查样品制备问题。这可以从简单的(将样品移入比色皿中)到复杂 的(用表面活性剂和超声波分散)。样品制备的主题超出了本文档的范围，但已在之前的技 术说明中讨论过。4使用 DLS制备样品进行分析时需要考虑的一些建议包括： ·测试浓度的影响。测量、稀释并再次测量。 ·测试测量时间的影响。测量3、5和10分钟。 ·确保任何稀释剂都经过充分过滤。 WFI 可能不够干净。 ·确保使用样品池都足够干净。 ·是否应使用过滤器去除样品中的大颗粒? ·哪个样品池合适。 ·调查任何可能影响结果的仪器设置。 优化样品制备步骤和仪器设置后，就可进行测试重复性实验。调查分析时间的微小变化是否 对结果有任何重大影响。如果该方法需要5分钟的分析时间，贝在4分30秒和5分30秒时测试。检查结果是否相同。 一旦方法得到优化，，下一步就是按照标准 FDA 指南记录该方法。5目标是足够详细地描述 程序，以便其他操作员可以执行相同的测试并生成相同的结果。列出了必须包含的基本信息： ·原理/范围：分析测试/技术的基本原理。 ·装置/设备：仪器类型、激光、检测器、检测角度和样品池类型。 ·操作参数：温度、粘度、分析时间和通道宽度。 ·试剂/标准品：用于验证性能的聚苯乙烯乳胶 (PSL)。 PSS 建议使用 90 nm PSL(请参阅 Entegris 技术说明·系统验证)。 ·标准控制溶液制备：稀释剂，稀释。6 ·程序：程序的逐步描述。将准备好的样品放入比色皿中，放入到系统中，定义参数并进行 测量。 ·系统适用性：测试以确保系统在使用时能够正常运行。6 ·计算：所有结果计算通常直接在 DLS 系统操作系统软件中进行。8可以在电子表格中进 行额外的统计计算。 ·数据报告：数字数据、格式、有效数字的表示。 Entegris 建议将结果重点放在光强强度 加权平均直径上。 关于参考标准和材料的说明 如上所述，我们认为单个粒径的测试足以验证系统是否正常运行。多家供应商提供多种粒径 标准品，客户可以选择他们推荐使用的样品。但是， Entegris 对两种 PSL 标准粒子拥有丰 富经验，这些也是我们通常建议客户用来验证 其 Nicomp的样本。Thermo Fisher 3000 系 列 NIST 可溯源 90 nm 标称 PSL 标准通常用于验证 Nicomp 性能。样品的目录号为 3090A，认证值为92±3nm。另 一 个经常使用的样品是 Thermo Fisher 目录号 5009A，值为 90 nm。该样品不可追溯到 NIST， 但我们有足够的经验推荐使用该样品，而且它比 3000系列产品便宜。 注： DLS 是一 种不 需要 校 准的第一 原 理 技 术 。该系统 使用 一种或 多 种 PS L 标 准 进 行验 证 。如 果 系统未通 过 验证步骤 ，则无法 进 行 调整 以使 结果进 入预 期范围 。验 证 结果失 败 可能是 由 于 系 统工 作 不 正 常而需要 维 修 ，或 者更常 见的 是标 准 粒子 准备不 当，应 在 尝试 另 一 次测 量之前重 新 准 备。 方 法验证 分析方法验证是证明分析程序适合其预期目的的过程5。并非所有验证特征都适用于粒度分 析。较早的 FDA 工业指南(非实施)草案文?包括一个专门针对粒度分析的部分。尽管较 新的已发布文件取代了较旧的指南草案，但有关粒度分析的较旧部分提供了有关粒度分析与 其他技术(如 HPLC)的不同之处的见解。旧文档中的以下声明有助于方法验证工作： “方法验证通常涉及中间精度和重复性的评估 。应保证生成的数据是可重复的，并控制产品 的质量。川7 考虑到这一评论， 下面提供了解决 DLS 方法验证的建议： ·特异性： N/A， DLS 检测大小变化但对不同化学物质不敏感。 ·线性： N/A， DLS 没有任何线性关系。 ·准确性： N/A，仪器的准确性使用标准粒子进行验证，但缺乏公认的定量裁判方法 (SEM/TEM 显微镜)不包括准确性确定。包括样品的 SEM/TEM 图像以支持方法验证可 能是更合适的。 ·精密度(重复性、中间精密度和重现性)：这是需要重点关注的地方。通常这些术语的 定义在粒度分析领域可能不同于其他技术。以下评论来自粒度分析领域： 重复性：多次测量样品。 重现性：准备样品、测量、丢弃、清洁、重复。建议的方法是制备五份样品，然后对每 个样品进行五次分析。 中间精密度：此活动涉及第 二 位分析员、第 二 台仪器或两者兼而有之。如果所有测试都 在一个地点进行，则由同 一 系统上的不同操作员在不同日期分析同一批次的样品。如果 要在多个地点进行测试，则同一样本(或批次)由不同操作员在不同地点的不同系统上 进行分析。 ·范围： N/A，仅在所用系统的工作范围内工作。无需对此进行测试或记录。 ·定量限： N/A，这只是测试粒径。 ·检测限：N/A，方法开发应确保样品在系统检测限内。 一旦 一 种方法得到验证，该程序就应该用于产品的生命周期。如果需要重复调整，则应重新 评估和重新验证该方法。 结果示例 两名操作员在两个 Nicomp DLS 系统上分析了 一 种药物物质(异丙酚乳剂)。该样品已过 期，但仍显示符合 USP <729> 的合格结果。仪器设置如下图： Instrument A： Instrument type Nicomp 380ZLS Age 5 years old Laser wavelength 958nm Laser power 35mW Detector PMT Detector angle 90° Software version ZPW388 V2.17.0215 Laser Wavelength 这一项删除 Instrument B： Instrument type Nicomp ZLS3000 Age new Laser wavelength 935nm Laser power 15mW Detector PMT Detector angle 90° Software version ZPW388 V2.17.0215 方法开 发 首先分析 92 nm PSL 标准以确保适当的系统性能 。测量结果在预期值的98%以内。建议 在开始此类工作之前进行此验证测试。 接下来进行快速研究以测试浓度(稀释)的影响。参见图1中的结果。 Conditions Mean PI 10 drops in 15 mL 212.4 0.082 10 drops in 15 mL 213.3 0.075 2：1 dilution 215.4 0.069 2：1 dilution 209.7 0.094 1 drop in 15 mL 208.7 0.092 1 drop in 15 mL 208.9 0.072 1 drop in KCL 204.9 0.064 1 drop in KCL 203.2 0.079 Figure 1. Data from method development 将10滴样品加入 15 mL 去离子水中并进行分析。重复相同的制备。然后将这些样品按 2：1稀释并进行分析。样品看起来太浑浊，结果发生变化，因此将下 一 滴添加到 15 mLDI 水中。样品出现轻微混浊，这些结果是可以接受的。有时，稀盐溶液是比纯去离子水更好的稀释剂。下 一 步是将 一 滴样品加入 10mL 过滤后的 10 mM KCl 溶液中。这些结果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他测量。 在进行稀释研究时，分析时间也从3分钟到10分钟不等 。三 分钟、五分钟和十分钟分析时 间的时间曲线图如图2-4所示。红色=光强粒径平均值，蓝色=体积粒径平均值，蓝色=数量 粒径平均值。 Figure 2. T ime history plot for 3 minutes analysis t ime Figure 3. T ime history plot for 5 minutes analysis time Figure 4. T ime history plot for 10 minutes analysis time 该方法选择了5分钟的分析时间。在五分钟的分析时间完成之前，光强平均粒径结果已经稳 定下来。但直到大约9分钟前，体积和数量加权平均结果仍在变化。这是也是在使用 DLS 时仅选择光强粒径结果的一个原因。这可能是方法开发中测试重复性很好的一个点。在这种 情况下，也许下 一 个测试的分析时间是四分半、五分和五分半钟。在这项研究中没有执行这 一 步骤，值得指出的是，整个方法开发和验证研究在不到8个小时内完成。更严格的最终发 布测试方法开发和验证方法很可能需要至少几天时间。 样品准备 ·在干净的瓶子里装满10毫 升过滤后的 KCl 溶液 ·用针头注射器取出0.5毫升异丙酚 ·在瓶子里注入1滴异丙酚和10毫升 KCl 溶液 ·手旋转直到完全混合(10秒) ·用一次性移液管将 400pL 样品移入圆形一次性玻璃样品池 ·将玻璃样品池放入黑色 Holder 支架·在 Nicomp 上打开样品盖 ·将样品池和支架插入 Nicomp 系统， Holder 支架背向 Nicomp 的左侧 ·关闭 Nicomp 上的样品盖 确保仪器设置与如下所示的值匹配： Temp 23°C Viscosity 0.933 cP Liquid index of refraction 1.333 Intensity setpoint 300 KHz First channel used 2 External fiber angle 90° Scattering angle 90° Print molecular weight unchecked Autoset channel width checked Autoset sensitivity checked Auto nicomp parameter checked Auto baseline adjust checked Cum % set point 10% Autodilution ND position N/A Number of print/save cycles 5 Using run time 5 minutes Using fit error unchecked Clear autocorrelator unchecked Print result unchecked Automatic choice of distribution unchecked Store data on disk checked Overwrite old file unchecked Save data log checked ·单击绿色“G”图标开始测量 ·打印并记录平均直径、标准偏差、PI、D10、D50 和 D90 ·将结果输入 Excel 电子表格 ·计算五项分析的平均值和变异系数 ·比较两个数据集 结果 样品在A和B系统上独立制备和分析。每个样品分析五次以检查重复性。这两个系统的 示例结果如图5和图6所示。 Run A Mean PI 1 200.8 0.094 2 200.5 0.088 3 199.9 0.088 4 199 0.091 5 199.3 0.094 Sum 999.5 0.455 Mean 199.9 0.9 Standard deviation 0.76 0.003 COV 0.38 0.330 Run B Mean PI 1 204.1 0.078 2 206.7 0.079 3 203.6 0.071 4 205.5 0.066 5 207.5 0.069 Sum 1027.4 0.363 Mean 205.5 0.0726 Standard deviation 1.66 0.006 COV 0.81 7.828 Figure 5. Example results from system A Figure 6. Example results from system B 整个结果以表格形式显示在图7和图8中。五个结果的叠加如图所示。 Figure 7. Summary results from system A F i gure 8. Summary result s from system B Figure 9. Overlay of five results 结论 查看综合结果可以得出以下几点观察结果： ·即使是相隔数年生产的两个系统也会生成相似的数据 ·两个系统之间存在明显的3%偏差 ·PI计算可能不是用于定义宽度分布的最佳值 ·如果使用PI，则30%的差值似乎是合适的 ·D10、D50、D90 结果显示出更好的重现性，可能更容易为制药行业所接受 纯粹基于该数据集，基于三个测量的该药物产品的规格可能类似于： ·光强平均值=200 nm±20%， COV= 小于 20% ·D10= 140 nm±30%， cov=小于 30% ·D90= 284 nm ±30%， cov=小于30%或 ·PI=0.09±30% 上述建议规格仅来自观察到的重现性，可能对药物安全性或有效性没有任何影响。 USP <729> 中的实际是否通过标准的要求只是粒径尺寸必须低于 500nm 并且具有低x²值。质 量标准的另 一 种方法可能是关注影响有效性和/或安全性的粒径大小。本技术说明收集的数 据是让您了解 DLS 技术对于简单样品的可重复性/重现性