AccuSizer A7000 在微球递送中的客户应用（一）

1.  引言帕金森病 (PD) 是一种进行性神经退行性疾病，其主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺( dopamine，DA) 能神经元进行性变性丢失，导致纹状体 DA 水平下降，在临床上主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍等症状。 PD 的病因学具有多因素，包括氧化应激和脑铁失调。目前的化学疗法基本上是使用外源性左旋多巴 (LD)（DA 的直接前体）作为药物进行对症治疗。然而，LD 给药与三个重要问题有关：① LD 代谢可产生细胞毒性自由基，破坏尚未受损的黑质纹状体的多巴能神经元，可加速帕金森病的发展；② LD 在中枢神经系统的生物利用度较低；③ 在长期治疗期间，给药后 LD 的血药浓度波动明显，进而导致大脑内突触间隙的多巴胺水平波动剧烈，对突触后多巴胺受体造成脉冲样刺激，从而导致运动并发症的出现。为了克服这些问题，最近合成了一种含有 LD 和天然硫辛酸部分（LA）的多功能前药（LD-LA，图 1）。硫辛酸很容易穿过血脑屏障 ( BBB ) 并在神经元中积累，具有抗氧化和铁螯合特性，可以减少儿茶酚胺的自动氧化（由过渡金属加速）和清除 LD 代谢产生的 ROS 。 LD-LA 对帕金森病症状的活性及其抗氧化效率已通过体外和体内研究得到证明。此外，与 LD 相比，口服 LD-LA 延长了 LD 血药浓度，因此这种前药在治疗与 LD 血浆水平波动直接相关的运动并发症特别有益。然而，LD-LA 儿茶酚酯和酰胺键在化学和酶促作用下均被裂解，导致血浆半衰期约为 50 分钟。因此，每天需要多次给药以保持 LD 的有效脑水平。在目前的工作中，将不稳定的前药 LD-LA 包埋在可生物降解的聚合物微球中，以保护该前药免受酶促和化学降解，并获得完整化合物的持续释放。聚乳酸-羟基乙酸( PLGA ) 具有良好的生物相容性和可生物降解性，用于制备载有前体药物的微粒。因此，它已被用于开发低分子量化合物以及治疗性蛋白质和质粒 DNA 的持续药物制剂。由于 LD-LA 的亲脂特性，PLGA 微球采用水包油乳液/溶剂蒸发法配制。研究了配方和加工参数对微球特性（大小、负载、释放）的影响。还强调了药物释放前后的稳定性以及控制 LD-LA 释放的潜在传质机制。4.  仪器设备AccuSizer颗粒计数器品牌：美国PSS（Entegris），AccuSizer A7000系列原理：单个粒子通过狭窄的光感区时阻挡了一部分入射光，引起到达检测器的入射光强度瞬间降低，强度信号的衰减幅度理论上与粒子横截面(假设横截面积小于光感区的宽度)，即粒子直径的平方成比例。用标准粒子建立粒径与强度信号大小的校正曲线。仪器测得样品中颗粒通过光感区产生的信号，根据校正曲线计算出颗粒粒径。PSS（Entegris）的SPOS单粒子光学传感技术，通过光散射增加对小粒子的灵敏度，将单颗粒传感器的计数下限拓展至0.5μm。A7000AD 采用自动稀释模式，可有效将高浓度样品快速稀释至合适浓度并进行检测。检测关键点：浓度、稀释液/分散液性质、流速。原理图仪器外观3.  样品制备及表征通过油包水乳液/溶剂蒸发技术(O/W，ESE)制备了LD-LA PLGA微球(Wischke和Schwendeman，2008)。简单地说，将 PLGA 和 LD-LA 以不同的浓度和药物/聚合物比例(PLGA/mL DCM 为200、400、800 mg/mL DCM；药物/聚合物比例为2%、5%或20%(w/w))溶解在DCM中，可制得 0.5 mL的油相。对于聚合物浓度较高的溶液，在室温下超声处理 30 min。使用均质机，将 o-ph 与含 PVA 2%(w/w)的水相( aq-ph )乳化(30 s，室温，25000分钟)。将得到的乳液滴入PVA水溶液(0.5% (w/w))中;2.5 或 5 ml)，硬化浴( hb )，在室温下磁力搅拌两小时，使DCM蒸发和微球凝固。或者，在不稀释的情况下搅拌乳液(表1)。在室温(3min，3000×g)下离心收集微球，然后用水洗两次，用液氮迅速冷冻，冷冻一夜进行干燥。使用 AccuSizer A7000 AD 对微球粒径分布进行表征分析，使用显微镜扫描电镜（SEM）对 AccuSizer 测量的微球粒径大小结果进行佐证。4.  实验结果该实验考察了配方参数(聚合物在有机溶剂中的浓度、相体积比、有机溶剂蒸发速率)对微球粒径大小的影响。表 1 显示，PLGA 浓度的增加导致微球尺寸和多分散性增加(例如比较 F2 和 F4)。这些现象可归因于油相粘度的增加导致搅拌效率的降低，从而产生多分散和更大的乳化液滴，从而产生尺寸范围相当宽的微球。为获得可储存的注射剂，通常粒径范围控制在20-100 μm，上述所有的配方都达到目标粒径范围。微球的多分散性与乳液基的制备技术相关。Accusizer 测量（图 2）表明，使用 200 mg PLGA/mL 的 DCM 溶液制备的微球具有相当窄的粒径分布，而随着聚合物浓度的增加 (800 mg/mL)，粒径范围变宽。 使用具有高 PLGA 浓度 (800 mg/mL) 的 DCM 溶液制备的颗粒是无孔的，且与 AccuSizer 数据（图 2）一致，显示出相当宽的粒径分布（图 3，F8）。5.  结论关键配方和加工参数会影响微球的粒径大小和孔隙率，从而影响药物释放速率。有机相中的聚合物浓度、相体积比和水相与有机溶剂的预饱和度对搅拌效率和油滴凝固速率具有重要影响，从而影响微球粒径大小、多分散性和孔隙率。使用AccuSizer A7000 系列可快速、准确测量粒径大小和粒径分布、从而筛选配方，节省研发时间。参考资料[1] E. D’Aurizio, C.F. van Nostrum, M.J. van Steenbergen, P. Sozio, F. Siepmann, J. Siepmann,W.E. Hennink, A. Di Stefano；Preparation and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres loaded with a labile antiparkinson prodrug.AccuSizer A7000 在微球递送中的客户应用(一) 引言 帕金森病 (PD) 是 一 种进行性神经退行性疾病，其主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺 (dopamine， DA) 能神经元进行性变性丢失，导致纹状体 DA 水平下降，在临床上主要表现 为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍等症状。PD影响着约 1%的60岁以上人 群，其主要临床症状包括运动障碍、焦虑、抑郁和痴呆。 PD 的病因学具有多因素，包括 氧化应激和脑铁失调。目前的化学疗法基本上是使用外源性左旋多巴 (LD)(DA 的直接前体)作为药物进行对症治疗。然而， LD 给药与 三 个重要问题有关： (I)LD 代谢可产生细胞毒性自 由基，破坏尚未受损的黑质纹状体的多巴能神经元，可加速帕金森病的发展。； (li)LD 在中 枢神经系统的生物利用度较低； (lii)在长期治疗期间，给药后 LD的血药浓度波动明显，进而 导致大脑内突触间隙的多巴胺水平波动剧烈，对突触后多巴胺受体造成脉冲样刺激，从而导 致运动并发症的出现。 为了克服这些问题，最近合成了 一 种含有 LD 和天然硫辛酸部分(LA)的多功能前药(LD-LA，图1)。硫辛酸很容易穿过血脑屏障(BBB) 并在神经元中积累，具有抗氧化和铁螯合特性 ，可以减少儿茶酚胺的自动氧化(由过渡金属加速)和清除 LD 代谢产生的 ROS。 LD-LA 对 帕金森病症状的活性及其抗氧化效率已通过体外和体内研究得到证明。此外，与LD 相比，口服 LD-LA 延长了LD 血药浓度，因此这种前药在治疗与 LD 血浆水平波动直接相关的运 动并发症特别有益。然而， LD-LA 儿茶酚酯和酰胺键在化学和酶促作用下均被裂解，导致血 浆半衰期约为50分钟 。因此，每天需要多次给药以保持 LD 的有效脑水平。 Fig.1.LD-LA (methyl O-acetyl-3-(acetyloxy)-N-{5-[(3R)-1，2-dithiolan-3-yl]-pentanoyl }-L-tyrosinate) molecular structure. 在目前的工作中，将不稳定的前药 LD-LA 包埋在可生物降解的聚合物微球中，以保护该前 药免受酶促和化学降解，并获得完整化合物的持续释放。聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)具 有良好的生物相容性和可生物降解性，用于制备载有前体药物的微粒。因此，它 已 被用于开 发低分子量化合物以及治疗性蛋白质和质粒 DNA 的持续药物制剂。由于 LD-LA 的亲脂特 性， PLGA 微球采用水包油乳液/溶剂蒸发法配制。研究了配方和加工参数对微球特性(大小、负载、释放)的影响。还强调了药物释放前后的稳定性以及控制 LD-LA 释放的潜在传质机 制。 仪器设备 AccuSizer 颗粒计数器 品牌：美国PSS (Entegris)， AccuSizer A7000 系列 原理：单个粒子通过狭窄的光感区时阻挡了 一 部分入射光，引起到达检测器的入射光强度瞬 间降低，强度信号的衰减幅度理论上与粒子横截面(假设横截面积小于光感区的宽度)，即粒 子直径的平方成比例。用标准粒子建立粒径与强度信号大小的校正曲线。仪器测得样品中颗 粒通过光感区产生的信 号 ，根据校正曲线计算出颗粒粒径。PSS (Entegris) 的 SPOS 单粒子 光学传感技术，通过光散射增加对小粒子的灵敏度，将单颗粒传感器的计数下限拓展至 0.5um. A7000AD 采用自动稀释模式，可有效将高浓度样品快速稀释至合适浓度并进行检测。检测关键点：浓度、稀释液/分散液性质、流速。 样品制备及表征 通过油包水乳液/溶剂蒸发技术(O/W，ESE)制备了 LD-LA PLGA 微球(Wischke 和 Schwendeman，2008)。简单地说， 将 PLGA 和 LD-LA以不同的浓度和药物/聚合物比例(PLGA/mLDCM 为 200、400、800 mg/mL DCM；药物/聚合物比例为2%、5%或 20%(w/w))溶解在 DCM 中，可制得 0.5mL 的油相。 对于聚合物浓度较高的溶液，在室温下超声处理 30min。使用均质机，将 o-ph 与含 PVA 2%(w/w)的水相(aq-ph)乳化(30s，室温，25000分钟-1)。将得到的乳液滴入 PVA 水溶液(0.5%(w/w))中；2.5或 5ml)， 硬化浴(hb)， 在室温下磁力搅拌两小时，使 DCM 蒸发和微球凝固。 或者，在不稀释的情况下搅拌乳液(表1)。在室温(3min， 3000×g)下离心收集微球，然后用 水洗两次，用液氮迅速冷冻，冷冻一夜进行干燥。 使用 AccuSizer A7000AD 对微球粒径分布进行表征分析，使用显微镜扫描电镜(SEM)对 AccuSize r 测量的微球粒径大小结果进行佐证 。 Table l Char a cter i stics of the different prod r ug lo a d e d m icrosphe r es for m ulations . Data are expressed as mean±SD(n=3). h b denotes hardening b ath. Formulation PLGA concentration in DCM Phases volume TDL(%) EDL(%) LE(%) Volume-weight o-ph (mg per DCM mL) pre-saturation of ratio (o-ph/aq-ph/hb) diameter (pm) aq-ph F1 200 No 1/1/10 2 1.5±0.2 59±3 16±8 F2 200 No 1/1/10 5 3.2±0.3 46±2 11±6 F3 200 No 1/1/10 20 14±1 46±5 13±9 F4 400 No 1/1/10 5 3.4±0.2 47±2 30±13 F5 400 No 1/1/10 20 14±1 37±3 21±11 F6 400 Yes 1/5/5 5 3.2±1 50±5 34±18 F7 400 Yes 1/10/0 5 2.7±0.9 37±8 30±15 F8 800 Yes 1/5/5 5 2.7±0.1 25±1 26±20 F9 800 Yes 1/10/0 5 2.6±0 15±8 28±23 a TDL (theo r etical drug loading ) expressed as ratio between mass of drug and mass of polymer used in formulation.b EDL (effect i ve drug l oading ) expressed as mass ratio of d r ug entrapped in microspheres.c eLE (loading efficiency) expressed as mass ratio of drug entrapped in mi c rospheres and drug used to prepare them. 实验结果 该实验考察了配方参数(聚合物在有机溶剂中的浓度、相体积比、有机溶剂蒸发速率)对微球 粒径大小的影响。表1显示， PLGA 浓度的增加导致微球尺寸和多分散性增加(例如比较 F2和F4)。这些现象可归因于油相粘度的增加导致搅拌效率的降低，从而产生多分散和更大的 乳化液滴，从而产生尺寸范围相当宽的微球。 Re l .% VOLUME-WT DIFF. DISTRIBUTION F E Diam.(pm)> Fig.2. Representative examples of size d i stri b ution results (volume-weig h t mean d iame t er ) o bt a ined b y A cc u sizer me a surement s .Top ： F2 f ormu l ati o n (P L G A i n D C M 200 mg/mL i n the o-p h). Bot t om： F8 formula t i on (PLGA in DCM 800 mg /mL i n the o-ph). 为获得可储存的注射剂，通常粒径范围控制在 20-100 um， 上述所有的配方都达到目标粒径 范围。微球的多分散性与乳液基的制备技术相关。Accusizer测量(图2)表明，使用200mg PLGA/mL 的 DCM 溶液制备的微球具有相当窄的粒径分布，而随着聚合物浓度的增加 (800 mg/mL)， 粒径范围变宽。 Fig.3. S.E.M. i mages of F2， F4，F6， F7， F8 and F9 microspheres formul a tions. 使用具有高 PLGA 浓度 (800 mg/mL) 的 DCM 溶液制备的颗粒是无孔的，且与 AccuSizer 数据(图2)一 致，显示出相当宽的粒径分布(图3，F8)。 结论 关键配方和加工参数会影响微球的粒径大小和孔隙率，从而影响药物释放速率。有机相中的 聚合物浓度、相体积比和水相与有机溶剂的预饱和度对搅拌效率和油滴凝固速率具有重要影 响，从而影响微球粒径大小、多分散性和孔隙率。使用 AccuSizer A7000 系列可快速、准确 测量粒径大小和粒径分布、从而筛选配方，节省研发时间。