重组蛋白（磷酸酶）离心方案

重组蛋白的生产是一项基本的生物技术，已应用于研究、医学和工业领域。这些蛋白质由转基因生物所产生。根据蛋白质的类型及其用途，可以使用许多不同的表达系统（例如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞）。如果需要对未知蛋白进行表征（即需要研究其结构和功能），那么需要目标产物的数量会更多。尤其是两个步骤会受此影响：必须扩大细胞培养和收获的规模（数升）。这对用于回收目标产物的仪器设备会提出更高的要求，同时也会导致更高的工作量（如果采用体量较小的设备）。本应用指南阐述了通过培养和收获细菌以及纯化蛋白质来生产重组蛋白的工作流程。目的是证明使用Innova S44i 摇床和高速落地离心机CR30NX 可以获得高产的功能性重组蛋白。为此，我们使用了离心收获套装，并辅以高速沉淀离心套件。这种搭配可以帮助用户轻松且有效地执行工艺流程的每一个步骤。表达系统：用pET28a 质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），该质粒含有编码带His 标签蛋白的人磷酸丝氨酸磷酸酶（hPSP）基因培养系统：使用Innova S44i 摇床（冷冻型，轨道直径2.5 cm）。该恒温摇床容量大，可以高速高效振荡大量培养物。因此，它非常适合以升为规模对培养物进行培养。离心系统：高速落地离心机 CR30NX 可与独特的6 L 转子（R9A2 固定角转）组合使用，搭载独特的1.5L 三角瓶，搭配中等体积R19A2 固定角转以及50 mL 锥底管可完成高速离心收获。eppendorf eppendorfAPPLICATION NOTEINo. 4511 Page 2 使用 Innova@ S44i 摇床和 4 x 1.5L 离心收获套 装生产重组人磷酸丝氨酸磷酸酶 Natascha WeiB1， Vincent Dufey?， Silvia Tejerina， Aurelie Tacheny² 1Eppendorf SE， Hamburg， Germany 2Eppendorf EAT， Namur， Belgium 摘要 重组蛋白质生产的目标是产生高产量的功能性蛋白质。实验 成功的重要基础是细胞的培养以及离心(离心是蛋白质分离 和纯化的基本技术)。本应用指南描述了用作概念系统验证 的重组人磷酸丝氨酸磷酸酶(hPSP)的生产流程。从 Innova@ S44i 摇床中细菌培养物的生长开始，使用装载6L 转子的高速离心机(CR30NX或 CR22N)，搭配 1.5L 三 角 离心瓶收获这些培养物。该离心收获套装可辅以“锥底管高 速沉淀离心套件”(转子含配套的50mL锥底管)，用于裂 解后续的分离操作。结果表明，这种产品组合高效灵活，可为 重组蛋白大规模生产工作流程奠定基础。 重组蛋白的生产是一项基本的生物技术，已应用于研究、医学 和工业领域。这些蛋白质由转基因生物所 产 生。根据蛋白质的 类型及其用途，可以使用许多不同的表达系统(例如细菌、酵 母、哺乳动物细胞、昆虫细胞)。 在此过程中，所需的 DNA序列(编码蛋白质的遗传信息)通过 分子克隆被引入宿主生物体。在选择表达重组蛋白的克隆后，对其进行培养。第一步，细胞繁殖，第 二 步，诱导基因表达。通 常会结合使用多种不同技术来分离和纯化所需的蛋白质。最 初，通过破碎细胞来分离蛋白质与其他细胞成分(裂解)。然后 利用其特性将靶蛋白与细胞的剩余蛋白分离，随后进行富集。 特别是如果需要对未知蛋白进行表征(即需要研究其结构和 功能)，那么需要目标产物的数量会更多。尤其是两个步骤会 受此影响：必须扩大细胞培养和收获的规模(数升)。这对用 于回收目标产物的仪器设备会提出更高的要求，同时也会导 致更高的工作量(如果采用体量较小的设备)。 因为易于被基因改造且培养速度很快，细菌大肠杆菌成为了 一 种普遍的表达系统。为了使得细胞生长足够且蛋白质表达 充分，需要一台能够以升为规模对培养物进行高速振荡的稳 健摇床。重组蛋白生产中的另一项重要技术是离心，因为它 通常涉及多个步骤。离心的目的在于收获细胞、澄清细胞裂 解物和(如有必要)浓缩蛋白质溶液(图1)。离心过程中必须 考虑以下要求：由于每个离心容器都需要大量手动操作步 骤，收获几升培养物就变得非常耗时(1)。一 方面是培养体积 会变化，另一方面体积较小就需要额外增加离心次数，而且 用于分离、纯化和浓缩蛋白质的参数又不同，这样一来就需 要额外使用离心容器、转子等设备，及其他可能需要的装置。 图1：基于3L培养体积的蛋白质生 产 程 示 例 (包括所需的培养和离心步骤)。 本应用指南阐述了通过培养和收获细菌以及纯化蛋白质来 生产重组蛋白的工作流程。目的是证明使用 Innova S44i 摇 床和高速落地离心机 CR30NX 可以获得高产的功能性重组 蛋白。为此，我们使用了离心收获套装，并辅以高速沉淀离心 套件。这种搭配可以帮助用户轻松且有效地执行工艺流程的 每 一 个步骤。 图2：重组蛋白表达系统：用 质粒pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，该菌株含有受lacUV5启动子控制且表达T7RNA聚合酶的基因。质粒pET28a携带有 受T7聚合酶控制的表达人磷酸丝氨酸磷酸酶 (hPSP)的目的基因。IPTG(异丙基B-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导Lac启动子，导致T7聚合酶的表达，并间接 导致hPSP基因的表达。 表达系统 用 pET28a质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)，该质粒含有编码 带 His 标签蛋白的人磷酸丝氨酸磷酸酶(hPSP)基因(图2)。 培养系统 为了培养细菌，使用了 Innova S44i 摇床(冷冻型，轨道直径 2.5 cm)。该恒温摇床容量大，可以高速高效振荡大量培养物。因此，它非常适合以升为规模对培养物进行培养。 离心系统 高速落地离心机 CR30NX可与独特的6L转子(R9A2固定 角转)组合使用，也可匹配 1.5L三角瓶，即上文提到的专为收 获大量培养物而设计的离心收获套装(图3)。该系统辅以高速 沉淀离心套件，该套件由 R19A2 固定角转以及 50 mL 锥底管 组成。 也可以使用 Centrifuge CR22N。为此，我们也提供相应的离 心收获套装和补充套件 https：//eppendorf.group/1mudft 有 关试剂 、耗 材和 其他 设备的详细信息 ，请参见 本 应用 指南的附录1。 图3：A)高速落地离心机CR30NX， B) 高速落地离心机 CR22N， C) R9A2固定角 转(4x 1.5L转子)，带1500mL 三 角瓶， D)R19A2固定角转，带50mL锥底管 亲和层析纯化 用3到5倍柱体积的蒸馏水洗涤 HisTrap FFcrude 层析柱，再用至少5倍柱体积的结合缓冲液进行平衡。持续搅拌 400mL澄清裂解液的同时，将其以 10mL/min 的流速缓慢加 入层析柱。用结合缓冲液清洗层析柱，直至吸光度达到稳定的 基线(约15个柱体积)。通过一步操作完成洗脱：前10个组 分用20%咪唑的洗脱缓冲液收集，而后10个组分用100 %咪唑的洗脱缓冲液以5mL/组分/分钟的流速收集。 浓缩 由于初步测试表明蛋白质溶液浓度足够高，因此未进行浓缩。 分析 >总蛋白的吸光度法定量(通过测量 280 nm 处的吸光度)。 >在还原和变性条件下通过 4-12%SDS-Page 电泳和考马斯 亮蓝染色来鉴定蛋白质。 >通过孔雀绿磷酸盐测定法测量酶活性。 结果与讨论 使用20%咪唑洗脱缓冲液从亲和柱中获得总共10个组分。这部分旨在去除杂质。随后用100%咪唑的缓冲液洗脱10个组分，目的是回收纯化的蛋白质。为了鉴别相关组分，测量了 它们在 280 nm 处的吸光度。 图4显示了吸光度测量的结果，显示了每个洗脱组分的总蛋 白质浓度的信息。可以清楚地看到，100%咪唑洗脱缓冲液 从柱中溶解下来了大部分蛋白质。其中蛋白质比例最高的位于 100%咪唑洗脱的第 二 个组分中(=组分12)。 为了确定靶蛋白人磷酸丝氨酸磷酸酶是否存在于各个组分中，存在的量以及它是否具有功能性，通过 SDS PAGE 对各个组 分进行了分离，然后进行孔雀绿磷酸盐测定，从而测量酶活性。用考马斯亮蓝染色的 SDS 凝胶证实大量蛋白质从组分11开 始逐渐被洗脱下来(用100%咪唑洗脱开始)(图5)。显示最 高蛋白密度的条带位置暨为靶蛋白hPSP，其大小为 25kDa。污染物在开始时被20%咪唑缓冲液洗脱下来。 孔雀绿磷酸盐测定法是一种比色法，可通过释放的磷酸盐量 来测定磷酸酶的活性。测定结果表明，大量功能性hPSP被含 图6：结合了每个洗脱组分的 酶活性(橙色条)和280nm 处的吸光度(蓝点/线)的测 量 图。 结果表明， Innova S44i 摇床和高速落地离心机 CR30NX 以 及上述实验配件可以成功地用于高产率的重组蛋白的生产和 纯化。凭借其稳健的设计和高容量， Innova S44i 摇床能够高 效地培养微生物，即使是大量培养物其也能应对自如(2)。上述 种种均是实现细胞旺盛生长和蛋白高表达的基本要求。 高速落地离心机 CR30NX 和 CR22N 配备众多转子和离心管 (包括可用于放大选项的连续流转子)，用途非常多样。由4x 1.5L转子和相应的1.5L 三 角瓶组成的离心收获套装是用于 收获细胞的最佳搭配。1.5L独特的三角形设计可以轻松实现 沉淀物再悬浮、上清液回收和瓶身的清洁。此外，单个瓶便可处 理1.5L培养物，节省了每个处理步骤的时间，包括：灌装、平 衡、封瓶、转子装载、倾倒、颗粒再悬浮和回收，以及每个瓶子的 清洗。第64号白皮书中提到，与处理6个1L容量的瓶子(6x 1L转子标配)相比，使用1.5L离心瓶可以节省32%的处理 时间(1)。还有一点揭示了该系统的高度灵活性：1.5L三角瓶 可不受最小装液量的限制(传统离心瓶就会受此限制)。根据应用情景的不同，可以额外搭配离心套件(转子和离心 管的组合)来对本离心收获套装进行扩展。只需要另外使用 一个离心套件(锥底管高速沉淀套件)即可涵盖从收获到浓 缩生产重组蛋白的所有离心步骤。这意味着Innova S44i摇床 和高速落地离心机可以应用于细胞培养、收获和后续纯化的 全流程步骤。 结论 本应用指南展示了成功使用Innova S44i摇床和高速落地离心 机 CR30NX(包括转子和容器)来生产重组蛋白的流程。除了具备产量高且功能经过验证的优点，各个实验步骤的执 行也十分高效。这得益于产品之间的组合使用使得各自的配 件实现了彼此间功能的互补，为实验流程提供了基本的框架 支撑。特别值得一提的是，独特的1.5L 三 角瓶以及灵活的离 心收获套装/套件组合使得操作方便且省时，为多种应用场景 提供了简明的解决方案。 Acknowledgement We thank Professor Johan Wouters (Laboratoire de Chimie Biologique Structurale (CBS)， Namur Medicine and Drug Innovation Center (NAMEDIC)， Namur Research Institute for Life Sciences (NARILIS)， University of Namur (UNamur)，B-5000 Namur， Belgium) for providing the hPSP plasmid. Literature [1]T Tacheny A. Unique 4 x 1.5 L Capacity Rotor for High-Speed Centr i fuges CR22N and CR30NX，Eppendorf White Paper No. 64 [2]Hartmann l， Jarvis J. The New Eppendorf X-Drive - Maximum Performance， Flexibility and Longevity for Demanding Shaker Tasks. Eppendorf White Paper No. 47 Ordering i nformation Description Order no. Innova" S44i， refrigerated， orbit 2.5 cm (1 in)， Europe， 230 V， 50/60 Hz S44I310001* Innova@ S44i， refrigerated， orbit 2.5 cm (1 in)， USA， 120 V， 50/60 Hz S44I210005 Innova@ S44i， refrigerated， orbit 2.5 cm (1 in)， Japan， 100 V， 50/60 Hz S44I010006 CR30NX Harvesting Bundle (4×1，5 L) +Rotor R9A2 incl. 4 x 1.5 L triangular bottles，incl. caps and tube vise， China/APA， 220V 5721 351511 CR30NX Harvesting Bundle (4×1，5 L)+Rotor R9A2 incl. 4 x 1.5 L triangular bottles， incl. caps and tube vise， EU/India， 220V 5721351512 CR30NX Harvesting Bundle (4×1，5 L)+Rotor R9A2 incl. 4 x 1.5 L triangular bottles， 5721351514 incl. caps and tube vise， EU/India (three-phase four-wire) CR30NX Harvesting Bundle (4×1，5 L)+Rotor R9A2 incl. 4 x 1.5 L triangular bottles，incl. caps and tube vise， US， 208V 5721351513 High-Speed Pelleting Kit for Centrifuge CR30NX： Rotor R19A2 (fixed-angle) 8 x50 mL，incl. 100 x50 mL high-speed conical tubes plus caps 5721 302107 CR22N Harvesting Bundle (4×1，5 L)+Rotor R9A2 incl. 4 x 1.5 L triangular bottles，incl. caps and tube vise， China/APA，220V 5721 261411 CR22N Harvesting Bundle (4×1，5 L) + Rotor R9A2 incl. 4 x 1.5 L triangular bottles，incl. caps and tube vise， EU/India， 220V 5721 261412 CR22N Harvesting Bundle (4×1，5 L) + Rotor R9A2 incl. 4x1.5 L triangular bottles， incl. caps and tube vise， US， 208 V 5721261413 High-Speed Pelleting Kit for Centrifuge CR22N： Rotor R15A (fixed-angle) 10 x 50 mL， incl. 100 x15/50 mL high-speed conical tubes plus caps 5721 221 007 *Last digit is country dependent. For UK/HKG， change 1 to 2； for Austra l ia， change 1 to 3； for China，change 1 to 4； for Argentina， change 1 to 8； for Brazil， change 1 to 9. Application Note No. 451，附录1：材料与方法补充细节 材料 试剂 SRAM 培养基： >100 mM MOPS 缓冲液， pH 7.4，含24 g/L 酵母提取物，16 g/L 胰蛋白胨， 10 g/L 酪蛋白水解物和10mL/L 甘油(100%) >高压灭菌 >加入500uL/L消泡剂20410%和2.5 mL/L 卡那霉素溶液(10 mg/mL，溶剂为 0.9%NaCI)。 1 mM IPTG 溶液(最终浓度) 裂解缓冲液： > 0.2 g/L 溶菌酶溶液，3000 U/L Benzonase@核酸酶，1mM MgCl2，20 片/L cOmplete，不含 EDTA的 蛋白酶抑制剂混合物溶于结合缓冲液 结合缓冲液： > 100 mM NaCl，25 mM HEPES， 10 mM 咪唑溶于分子生物学级水 >调节pH至7.4 >使用前经 0.22uM过滤器过滤 洗脱缓冲液(100%和20%咪唑)： > 100 mM NaCl ， 25 mM HEPES，250 mM 咪唑(100%)或 50 mM 咪唑(20%)溶于分子生物学级水 >调节 pH至7.4 >使用前经 0.22uM过滤器过滤 耗材 > Ultra Yield@250mL 和2.5L 无菌培养瓶(Thomson) >AirOtopTM Enhanced Seals 透气盖，适用于 Ultra Yield 250 mL 无菌专利培养瓶(Thomson)和2.5L 无菌专利培养瓶(Thomson) > HisTrap@ FF crude 5 mL 预装柱(GE Healthcare) 设备 > Watson Marlow 323 dz 蠕动泵 > Q500 超声波破碎仪，带V2"探头(QSonica @) > NanoDrop@ ND 2000 超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific) > xMark 微孔板分光光度计(BioRad) 方法 光度分析 通过测量 280 nm 处的吸光度，进行总蛋白吸光度定量。 SDS PAGE 电泳和 Coomassie Blue 染色 通过用考马斯亮蓝染色的 4-12% SDS-PAGE 验证蛋白质 hPSP 的纯度，同时确定不同组分中是否存在污染物。按照 NuPAGEQ 技 术指南(Thermo)制备用于还原和变性条件下的凝胶电泳的样品和缓冲液制剂。将 4.37 uL NuPAGE LDS 样品缓冲液和 1.75 uL NuPAGE 样品还原剂添加到 11.4 uL样品中(分别取自每个组分)。将混合物在 70℃ 下加热10分钟，以完成还原和变性，然后将每 个样品(16uL)上样到 NuPAGE 4-12% bis-Tris 蛋白凝胶(1.0 mm， 10 孔(Thermo))的孔中。蛋白质分子量标记物已上样到每个凝 胶中。凝胶在 XCell SureLockQ 小型电泳槽(Thermo)和 NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液(Thermo)中以200V恒定电压运行，电流：初始电流：125mA/凝胶，终末电流：70-80 mA/凝胶，持续35分钟。电泳后，在振荡器上以 60 rpm 的震荡速度用去离子水将凝胶 清洗 15分钟。使用 GelCode@Blue Safe 染色剂(Thermo)在室温下以60 rpm 的搅拌速度对蛋白进行染色1小时。在扫描前，用超 纯水代替染色试剂，以 60 rpm 的震荡速度在室温下将凝胶漂洗脱色2小时。 酶活性测定 使用孔雀绿磷酸盐分析试剂盒(Sigma)测定磷酸盐含量来鉴定酶活性。当 酶促反应产生无机磷酸盐时，该方法可使用孔雀绿来对在 620 nm 处形成的磷钼酸盐进行定量。96孔板中每孔80 uL样品。 每孔加入20 uL 工作试剂。将样品在室温下孵育30分钟，让其显色。然后用酶标仪在 620 nm 处测量吸光度。 相关应用指南 https：//eppendorf.group/jh512a www.eppendorf.cn Eppendorf China Limited 艾 本 德 中国 有限公司 上 海：021-38560500 北 京：010-88360998 广州 ：020-83754160 服务热线：400885 6070 电 子邮 件 ： marketin f o@eppendor f .cn Ben z onase °was a reg i stered t ra de mark o f MERCK KGaA. cOmplete ° was a re g istered tr a d e ma r k o f Roche . Ul t ra Yie ld i s a r e g i st e r ed t r ademark of Sc i ent if ic Plasti c P roduct s (SPP). H isTr ap° i s a re g istere d tr ad ema r k o f Cytiv a Bioprocess R SD AB. Na no dro p i s a r egi s te r ed t r ade m ark of Na n odrop Technolo g ies LL C. Bi o -Ra d i s a r egi s te r ed t r ademark of Bio-Rad Labo r a t ories， I nc. QSo ni ca " is a r e gister e d tradema r k of So nic s 8 Ma t e ria ls Inc. Coomassie is a r e gistere d t r a dem a r k of ICI L td . NuPa g e* an d XCell SureL o ck a re registered t r a dem a r ks o f Li fe Te c hno lo gi e s. Gelcode * is a regist e red tr a demar k of Pierce B iotechnology， Inc . AirO t opT M is a t radema rk o f Sc i e nti f ic Pla s tic Produc t s (SPP).E ppendo rf a n d t h e E ppe n d orf Brand Design are reg i s t e r ed trademarks of Eppe n dorf SE， G e rmany . Al l rig h ts r e s e rved ， incl ud i ng graphics and i mages. Copy r ig ht @ 2022 b y Eppendorf SE， G e rmany