酱油中氨基酸检测方案

思百 思百i思百 思百可 思百可 思百可 思 应用 CAMO 多变量分析软件完成酱油中总酸和氨基酸态氮成分的预测及研究 思百可 王斌 郭峰 北京思百可技术有限公司 思百 思 摘要： 本文论述了应用CAMO软件实现酱油中总酸和氨基酸态氮的预测及研究，根据近红外(NIR)光谱的振动吸收强度与被测物质特征信息之间的关系，对酱油样品采集近红外光谱，透射光谱经过基线校正处理后，采用偏最小二乘(PLS1)以及完全交互验证法，与酱油总酸和氨基酸态氮进行线性回归，建立了预测模型。用该模型对随机抽取未参与建模的8个酱油样品的总酸和氨基酸态氮进行了预测，预测结果的相关系数分别为：R1=0.97；R2=0.98以及标准偏差分别为： STDEV1=0.09； STDEV2-0.07 **，该文章应用[模型回归系数图]，解析了被检测物质成分与模型之间的关联性。 关键词： CAMO软件，酱油，总酸，氨基酸态氮，近红外光谱 酱油是我国人民日常生活中不可缺少的传统调味品，以蛋白质及淀粉等为原料，经微生物发酵而成，富含多种营养成分，集调色、调味于一体，能增进食欲、助消化。酱油在酿造过程中，氨基酸态氮是酱油呈鲜味成分的特征指标，其含量的高低可表示鲜味的程度，也是质量好坏的指标。总酸也是反应酱油质量主要指标之一。各种有机酸与相应的醇类可酯化成具有芳香气味的各种酯，使酱油具有特殊的风味和醇厚的口味，所以酱油中总酸、氨基酸态氮的含量是其重要的质量指标示。 . 检测酱油中主要成分含量的意义 思百 GB2717-2003酱油卫生标准理化指标中严格规定氨基酸态氮含量不得少于 0.4g/100mL，总酸含量不得超过 2.5g/100mL。不合格的酱油产品若流入市场，必将对广大消费者的健康带来极大的危害，因此商检机构对酱酱经销销业必须实行严格的质量监督，定期送检样品，检测合格后方可上市销售。 思百 思百 酱油属于最早发放食品生产许可证的产品，虽然目前产品合格率与发证之前有了大幅提高，但在全国看来合格率还是不能让人乐观。大多数生产企业获证后能够按照食品生产许可证细则的要求，严格按工艺要求组织生产；但个别企业获证后对生产工艺和产品质量就放松了要求，导致最终投放市场上的酱油品质参差不齐。为此，执法机关加大了对酱油抽查的力度，对卫生指标不合格的企业实施加严检验，产品在加严检验全部合格之后，企业才能恢复正常生产。通过检测酱油产品中总酸和氨基酸态氮指标，可指导各级工商行政管理机关及时查处不合格的酱油产品，使其下架、退市并销毁。在执法过程中要加大对质量违法行为的查处力度，对照辖区内所有食品经销企业、超市、个体门店、综合批发零售市场逐个批次地检查清理，凡属公布名单中涉及的不合格商品，要按照《产品质量法》的有关规定严肃查处并立即销毁，这样就防止了不合格商品二次流入市场，避免对人民的身体健康造造危害。 为此，食品商检部门急需寻找一种简单、快速和准确的方法检测酱油中总酸和氨基酸态氮指标，这对食品的有效卫生监督管理以及质量控制具有十分重要的意义。 思百可 六一 思百可 思 思百可 思百可 思百可 思 思百 思百可 2. 近红外光谱技术快速检测原理 思百 酱油中总酸和氨基酸态氮的传统测定方法是依据 GB/T5009.39-2003酱油卫生标准。该方法中规定：总酸采用酸度计滴定法、氨基酸态氮采用甲醛值法。这种传统检测方法由于试剂配制需要花费大量的时间，因此不可能对市场上的商品进行及时监测。 思百 众所周知，由于计算机技术、电子技术以及化学计量学的发展，近20年来近红外光谱技术应用得到了迅猛地发展。大多数的有机化合物在近红外区域都具有特征吸收，根据不同物质对应近红外区域内不同波长处的特征吸收，应用比尔定律I](A=EXc 式中A一吸光度，c一浓度，E一消光系数)以及化学计量学模型算法，我们很容易建立出被测物质成分的计量模型，应用该模型可以非常便捷地实现物质成分的快速分析。近红外光谱分析技术以她快速、无损、无污染、样品无须前处理、低成本且高精度等检测优点，如今已越来越受到食品质量检测领域的青睐。 思 3. 采集样品及建模方法 最近我们应用近红外光谱仪完成了对贵州省贵阳市、六盘水市、遵义市三个地区的-50个酱油样品测量(其中样品囊括了北京、湖南、广东等几十个酱油生产厂家)。酱油是深棕色液体，根据样品的特性，我们选用1毫米光程长比色皿盛载液体样品并对它们实行透射测量(见图1透射测量下酱油样品的近红外吸光度光谱)。 Fig. 1 Absorption spectra of Chinese sauce 图一.449个酱油样品的近红外吸光度光谱图 思百可 思百可 3.1测量设备及参数 3.1.1 近红外光谱仪 思百 3.1.2供透射测量用的光纤样品架 3.1.3 2根信号导入光纤 思百可 思百可 3.1.4 1mm 光程长石英样品池 3.1.5 测量波长：350nm—2500nm 3.2测量及建模方法 思百C 3.2.1 每个样品测量时间：1.5秒/10遍全光谱扫描 3.2.2 测量空白比色皿作为参考本底 思百可 思百可 3.2.3 应用 CAMO 计量化学软件的 PLS1偏最小二乘法以及完全交互验证方法建模 思 思百 思百 3.3模型精度 3.3.1 酱油总酸模型(见图2) 思百C 思百 思e Fig.2 The parameter of the Model of Chinese sauce’s total acid 思百 图二. 酱油总酸模型的精度参数以及相关特性图 思百可 其精度指标为： 校正模型： Corr.=0.98 RMSEC=0.10；预测模型： Corr.=0.95 RMSEP=0.18 主成分数 Pcs=10 注：易除5个样品，实际建模样品数为44个) 3.3.2 酱油氨基酸态氮模型(见图3) Fig.3 The parameter of the Model of Chinese sauce’s amino acid nitrogen 图三. 酱油氨基酸态氮模型的精度参数以及相关特性图 其精度指标为： 校正模型： Corr.=0.99 RMSEC=0.05；预测模型： Corr.=0.97 RMSEP=0.07 思百C 主成分数 Pcs=8 (注：易除3个样品，实际建模样品数为47个)思百可 思 思百可 思百可 思百可 4， 模型回归系数分析 4.1酱油氨基酸态氮回归参数分析 47-JY-TANJN-Mo? (Y-var，PC)：(ANJN，8) B0=0.297521 (nm) Fig 4. The Regression Coefficients of the Model of Chinese sauce’s amino acid nitrogen图四.酱油氨基酸态氮模型的回归系数特征图 思 上图是酱油氨基酸态氮模型的中回归参数图，从该图上可将氨基酸态氮回归参数在全光谱范围内的正相关参数区域划分出来，即：530nm—600nm； 680nm—790nm； 1070nm—1440nm以及1440nm—1660nm。 氨基酸态氮是以氨基酸形式存在的氮，根据酱油氨基酸态氮的化学分子式[6] [7] ：R—CH(NH2)-COOH， 不难看出测量的主要化学键能吸收是N一H键，该键伸缩振动的光谱吸收谱带是： 级倍频在1500nm附近；二级倍频在1050nm附近；三三级倍频在800nm附近[4][5]它们与我们建立的酱油氨基酸态氮模型回归参数的最大正相关参数的位置相一致，由此证明酱油氨基酸态氮模型建立在N一H键能吸收的基础上， N—H键能吸收的多少直接反映了酱油氨基酸态氮的成分含量。 Fig5. The Regression Coefficients of the Model of Chinese sauce’s total acid 图五. 酱油总酸模型的回归系数特征图 思 思百 思 思百可 思百 思百 酱油总酸模型的光谱信息分析与氨基酸态氮模型的回归参数分析同理。我们依然可以在酱油总酸模型回归参数图上找到并划分出6段正相关参数的光谱区域：520nm—570nm； 650nm—730nm； 1240nm-1320nm；1320 nm—1390 nm； 1730 nm—1880 nm以及2000nm-2200nm。酱油总酸中的主要成分是乳酸[6]，其化学分子式为：CHCHOHCOOH， 由此可以得出模型相关信息是来自于羧酸 (COOH) 中的O—H 以及C一H键能的吸收特性，根据《Foliar Spectral Features》4，我们找到了这些化学键各级倍频的中心位置：O—H键合频在2100 nm附近， C一H键的一级倍频在1730 nm附近；一级倍频合频在1390nm附近；二级倍频在1240nm附近。通过比较发现：这些光谱回归参数的正相关中心位置与《Foliar Spectral Features》上的OH以及C一H键能吸收位置相同，由此证明了酱油总酸近红外光谱模型是通过分析酱油总酸分子中的O一H键以及C心H键能的变化而实现的。 思 5. 预测结果 尽管此次实验的酱油样品数量有限，但我们仍要考察模型的预测能力。我们分别从酱油总酸模型以及氨基酸态氮模型的数据中任意提取8个样品，余下的样品仍然沿用上述方法建模，构成了36个酱油样品的总酸模型以及39个酱油样品的氨基酸态氮模型。应用这新建立的模型分别预测未参与建模的8个酱油样品，获得表1及表2预测结果。 思 思百可 表一. 应用酱油总酸模型预测未知的8个酱油样品的总酸结果 Table l Comparison the total acid between laboratory valuesand NIR predicated values of unknown sauce samples 思 思百 序号 样品 预测值 参考值 偏差 1 14JY-002 0.50 0.64 -0.14 2 14JY-006 1.53 1.62 -0.09 3 14JY-011 1.71 1.74 -0.03 4 14JY-017 1.03 0.97 0.05 5 14JY-018 1.16 1.13 0.03 6 14JY-019 0.99 0.90 0.09 7 14JY-046 1.03 0.98 0.05 8 14JY-047 2.20 2.09 0.11 STDEV 0.09 思百己 思百可 思百表二.应用酱油氨基酸态氮模型预测未知的8个酱油样品的氨基酸态氮结果 思百可 Table 2 Comparison the amino acid nitrogen between laboratoryvalues and NIR predicated values of unknown sauce samples 序号 样品 预测值 参考值 偏差 14JY-004 0.36 0.48 -0.12 14JY-009 0.88 0.80 0.08 3 14JY-020 0.43 0.51 -0.08 4 14JY-032 0.41 0.45 -0.04 5 14JY-041 1.24 1.20 0.04 6 14JY-042 0.89 0.91 -0.02 14JY-043 1.11 1.08 0.03 8 14JY-044 0.59 0.66 -0.07 STDEV 0.07 思百可 思百可 思 从酱油总酸、氨基酸态氮预测结果与参考值偏差的 STDEV以及图6和图7的相关性，可以得到如下结论： 思百 5.1 应用近红外光谱分析方法可以快速准确地评价酱油中总酸和氨基酸态氮成分 5.2 用酱油总酸和氨基酸态氮模型对随机抽取、未参与建模的8个酱油样品预测结果的相关系数分别为： R1=0.97； R2=0.98以及标准偏差分别为： STDEV1=0.09； STDEV2=0.07** 思 5.3 通过对酱油测量获取的成功经验，我们可以迅速将近红外光谱分析技术扩展到其它食品检测领域中，这样做不仅使我们的食品质量检验迈上一层台阶，更重要的是保证证我们国家广大消费者的健康与安全。 思 思 思百可 思 思百 酱油氨基酸态氮模型预测结果相关性 Fig.7 WB 2006-6-30 BJ 思 思 思百 6. i问题探讨 思百 通过大量的研究及实验我们发现在应用近红外光谱技术的建模过程中，真真的准确性是需要反复考证的，因为她是样品模型建立过程中的第二关键步骤(a.样品采集 b.测量真值 c.采集光谱 d.数据预处理e.模型建立)，直接关系到样品最终模型精度的优劣，也就是说：我们最终建立的模型精度不可能优于参考真值的精度[213]。此次实验中总酸的真值就是通过第二次测量才得到了比较准确的数值，因为当使用第一次测量的总酸真值作为参考数据时，得到的模型结果是没有相关性的，根据经验判断是真值测量的准确度有问题，所以立即让有经验的高水平实验员对总酸真值进行第二次测量，并应用新测量的总酸真值与原来测量的光谱 思 思百 思 思百可 思百 数据联立建模，结果非常好!(见图2)从而证明问题分析判断准确无误。酱油样品总酸校正模型的相关性达到了R=0.98，校正模型预测结果果标准方差仅为 RMSEC=0.10。另外，需要特别指出的是：样品的真值测量时间与光谱测量时间应该尽可能靠近，因为某些样品会随着时间的推移而发生质变，譬如：酸败或发霉等，如果出现此类情况，原来测量的真值就不准确了。为了得到一个稳健的预测模型，应该充分发挥CAMO多变量分析软件的功能，譬如：对于原始数据的预处理方法选择以及样品测量波长的筛选，实践证明使用二阶微分数据建立的模型效果最优。 思百可 思百可 思百可 思百可 ( 参 考 文j献 ) 思 ( [1].陆婉珍，袁洪福，徐广通，强冬梅 《现代近红外光谱分析技术》 北京：中国石化出版 社，2000： 1 9~26，109 ) {21.王斌，魏志奇，李霞《乙醇浓度测量模型的建立与应用》(分析化学)2005.33(9)：1361~1362 [3].江泽慧，黄安民，王斌《木材不同切面的近红外光谱信息与密度快速预测》 (光谱学与光谱分析) 2006， 26(6)：1036 思 [4]. Foliar Spectral Features PaulJ. Curran，(1989)，Remote Sensing of Foliar Chemistry，‘Remote Sensing of Environment’(环境遥感)(1989) 30：271-278 [5]. George W. Gokel(USA) DEAN'S HANDBOOK OF ORGANIC CHEMISTRY 《有机化学手册》 (化学工业出版社)2006：551~552 [6].谢达平《食品生物化学》(中国农业出版社)2004：61~62 思 [7].李里特《大豆加工与利用》 (化学工业出版社)2003：216~240 思百 ** R1总酸的相关系数；STDEV1总酸的标准偏差R2氨基酸态氮的相关系数；STDEV2 氨基酸态氮的标准偏差 思百 作者简介： 思百 思百可 思百可 王斌 北京，北京思百可技术有限公司100080， Tel.： +86-10-64016630 13910580691 E-mail： bj_spectrum@sina.com 思百C http：//bj spectrum.instrument.com.cn 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思百可 思 思百可 思百可 思百可 思可 思