LC-MS/MS法测定饮料中香豆素类化合物

本文使用岛津超高效液相色谱仪与三重四极杆质谱仪联用，参考BJS 202203《饮料中香豆素类化合物的检测》，建立了饮料中8种香豆素类化合物的分析方法，并进行了详尽的方法学考察。实验结果表明，该方法前处理简单，灵敏度高，专属性强，满足标准要求，可为相关从业人员提供参考。SSL-CA23-133Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-768 LC-MS/MS 法测定饮料中香豆素类化合物 LCMSMS-768 摘要：本文使用岛津三重四极杆液质联用仪建立了饮料中8种香豆素类化合物的分析方法。使用外标法定 量 ，在各自校准 曲 线浓度范围内，各组分线性相关系数大 于 0.9983，检出限在0.001 ng/mL -0.243 ng/mL 之间。使用低、中、高浓度标准品溶液分别连续进样6针，保留 时 间 的 RSD 在 0.01%-0.12%之间，峰 面 积 的 RSD 在 0.66%-2.93%之 间 。前处理简单，加标回收率良好。该方法满足食品补充检验方法要求，可为相关从业人 员提供参考。 关键词：：三重四极杆液质联用仪 香豆 素 饮料 技术特点： 小使用同时注入(Co -injection) 功能，有效地改善了溶剂效应。 香豆素类化合物是一类重要的杂环化合物，母环结 构为苯并 吡 喃酮，广泛存在于自然界的植物中，如芸香 科、伞形科、菊科、豆科等。作为一类重要的天然香料，常用作定香剂 、脱臭剂，配制香水和香料，也用作饮料 、食品、香烟 、塑料制品、橡胶制品等的增香剂。 由毒理实验发现，香豆素对小鼠胚胎有毒性，能引 起痛觉消失，使中性胆碱酯酶发生变化，对大鼠为可疑 致肿瘤物，由致癌性判定，动物为阳性反应。香豆 素 对 人类的肝脏 也 有危害，2017年世界卫生组织国际癌症研 究机构公布 的 致癌物清单中，香豆素为3类致癌物，因 此，香豆素不允许作为添加剂直接使用，但其衍 生 物6-甲基香豆素、八 氢 香豆素和二 氢 香豆素允许作为食品用 合成香料使用(见GB2760-2014表B.3)。 2022年2月7日，国家市场监督 管 理总局发布并 实施 BJS 202203《饮料中香豆素类化合物的检测》。本实验参考该标准，使用岛津三重四极杆液质联用仪建 立了饮料中香豆素类化合物的检测方法，，可为相关从业 人员提供参考 。 1.1仪器 岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8045，配置信息如下： 系统控制器：：CBM-40A 脱气机： DGU-405 输液泵 ：LC -40D XR×2柱温箱 ：CTO -40C 自动进样器： SIL-40C XR 质谱 仪：LCMS-8045 色谱工作站： Labsolutions Ver . 5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：Shim-pack GIST C18-AQ (150 mm x 2.1 mm l .D.， 1.9 um，岛津(上海)实 验 器材有限公司， P/N： 227-30807-03) 流 2动相 A-0.1%甲酸水溶液；B-乙腈 进样体积 10uL 同时注入 40 uL水 流 速 束： 0.3 mL/min 柱 温 ：40°C 洗脱方式： 梯度洗脱，B相起始浓度为30%，时间程序如表1所示。 表 ]1 梯度洗脱时间程序 时间 (min) 单元 处理命令 值 2.00 泵 B Conc 30 13.00 泵 B Conc 90 14.00 泵 B Conc 90 14.01 泵 B Conc 30 17.00 控制器 STOP 质谱条件 MRM 参 数： 见表2 表2 MRM 参数 序号 化合物名称 CAS 号 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 香豆素 91-64-5 147.00 103.05* -10 -17 -17 91.10 -16 -23 -17 2 7-甲氧基香豆 素 531-59-9 177.05 121.05* 134.10 -12 -23 -12 -19 -25 -26 3 二氢香豆素 119-84-6 149.00 107.05* -16 -19 -11 121.10 -16 -16 -12 4 7-甲基香豆素 2445-83-2 161.00 105.10* -11 -22 -10 115.10 -29 -21 -25 5 7-乙氧基-4-甲 基香豆素 87-05-8 205.05 177.10* -10 -19 -18 105.10 -22 -24 -19 6 醋硝香豆素 152-72-7 354.05 249.05* -10 -39 -12 163.05 -18 -15 -29 7 环香豆素 518-20-7 323.05 251.05* 173.05 -23 -17 -28 -16 -31 -30 8 3，3'-羰基双(7-二乙胺香豆素) 63226-13-1 461.15 244.05* -13 -19 -11 160.15 -17 -54 -16 *代表定量离子对。 1.3标准品溶液的配制 取标准品各适量，精密称定，用乙腈溶解分别制成100 mg/L 的标准储备液。取储备液各适量，使用乙腈 稀释 制 成1 mg/L的混合标准中间液。吸取混合标准 中 间液适 量 ，用乙腈配制成2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的混合标准系列工作液。 1.4样品前处理 参照 BJS 202203《饮料中香豆素类化合物的检 测 》，液体试样前处理流程见图1。 图1样品前 处 理流程图 ■结果与讨论 2.1标准品溶液的 MRM 色谱图 环 香豆素 3，3'-羰基双(7-二 乙胺香豆素) 图2标准品溶 液 MRM 色谱图 (5ng/mL) 2.2校准曲线和检出限 按照1.2项下分析条件，标准系列溶液按照浓度从低到高的顺序依次上机 测 定，以待测物的质量浓度为横坐 标，其对应的峰 面 积为纵坐标，绘制校准曲线，如图3所示。8种香豆素类化合物在校准曲线浓度范围内线性 关系良好，相关系数r大于0.9983，各校准点准确度在86.7%-107.7% 之间。根据各化合物最低浓度点标样数据，以3倍信噪比计算检 出 限，各化合物检 出 限及线性相关系数如表3所示。 Area 2.0e6- 1.5e6- 1.0e6- 5.0e5- 0.0e0十 一 Conc .(ppb) Area 1.0e7- 8.0e6- 6.0e6- 4.0e6- 2.0e6- 0.0e0- Conc .(ppb) Are a 6.0e7- 5.0e7- 4.0e7- 3.0e7- 2.0e7- 1.0e7- 0.0e0- 环香 豆 素 3，3'-羰基双(7-二 乙胺香 豆 素) 图33校准曲线 表3各组分相关系数及 检 出限 序号 化合物名称 相关系数(r) 准确度(%) 检出限(ng/mL) 1 香豆素 0.9998 95.3-103.3 0.041 2 7-甲氧基香豆素 0.9991 88.7-107.0 0.012 3 二氢香豆素 0.9995 95.9-105.2 0.243 4 7-甲基香豆素 0.9998 95.2-102.3 0.015 5 7-乙氧基-4-甲基香豆素 0.9983 86.7-107.7 0.001 6 醋硝香豆素 0.9999 97.9-101.7 0.002 7 环香豆素 0.9985 87.1-105.3 0.001 8 3，3'-羰基双(7-二乙胺香豆素) 0.9998 96.9-102.2 0.001 2.3重复性 实 验 取标准品溶液低(4ng/mL)、中 (25ng/mL)、高(40 ng/mL) 3个浓度水平，每个浓度水平连续进样 6次，考察仪器的重复性。结果如表4所示，8种香豆素类化合物保留时间的 RSD 在 0.01%-0.12%之间，峰面 积的 RSD 在 0.66%-2.93%之间，仪器精密度良好。 表4 重复性结果 化合物名称 4ng/mL 25ng/mL 40 ng/mL 序号 保留时间 SD(%) 峰面积 RSD(%) 保留时间 RSD(%) 峰面积 RSD(%) 保留时间 RSD(%) 峰面积 RSD(%) 1 香豆素 0.04 2.42 0.10 1.29 0.10 1.13 2 7-甲氧基香豆素 0.02 2.23 0.11 2.82 0.12 2.93 3 二氢香豆素 0.08 2.84 0.10 2.02 0.08 1.43 4 7-甲基香豆素 0.02 1.58 0.06 0.76 0.07 1.24 5 7-乙氧基-4-甲基香豆素 0.02 2.46 0.04 1.94 0.05 0.66 6 醋硝香豆素 0.02 2.52 0.03 2.06 0.04 1.29 7 环香豆素 0.01 1.02 0.03 1.33 0.02 2.33 8 3，3'-羰基双(7-二乙胺香豆素) 0.01 2.01 0.03 2.51 0.02 2.46 2.4加标回收率 取空白饮料 样 品进行加标回收测定，分别添加标准品溶液低 (4ng/mL)、中 (25 ng/mL)、高(40 ng/mL)3个浓度水平，按照上述所建立的方法进行样品处理及测定。每个浓度水平重复3份平行样品，计算加标 回收率和相对标准偏差(RSD)。结果如表5所示，8种香豆素类化合物的加标回收率在88.6%-111.1%之间，RSD 在 0.12%-3.96% 之 间。 表5名各 组 分添加回 收 率结果 序号 化合物名称 4ng/mL 25ng/mL 40 ng/mL 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 1 香豆素 88.6 1.32 94.4 1.97 92.0 0.16 2 7-甲氧基香豆素 89.3 3.96 96.8 2.45 92.5 3.71 3 二氢香豆素 106.2 0.69 97.4 1.32 94.3 1.95 4 7-甲基香豆素 88.7 2.64 94.9 1.49 92.5 2.28 5 7-乙氧基-4-甲基香豆素 94.9 0.12 98.8 0.28 91.1 0.73 6 醋硝香豆素 95.6 0.56 95.4 1.12 92.1 1.59 7 环香豆素 107.6 3.02 111.1 1.30 103.4 0.61 8 3，3'-羰基双(7-二乙胺香豆素) 107.6 2.46 109.0 3.14 102.4 0.85 结论 本文使用岛津超高效液相色谱仪 与 三 重四极杆质谱仪联用，参考 BJS202203《饮料 中 香豆素类化合物的检测》，建立 了 饮料中8种香豆素类化合物的分析方法，并进行 了 详尽的方法学考察。实验结果表 明 ，该方法前处理简单，灵敏度高，专属性强，满足标准要求，可为相关从业人员提供参 考 。 岛津应用云