内源差示扫描荧光技术如何应用到多功能蛋白质稳定性分析

蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，具有特定立体结构的和生物活性以及诸多功能，根据这些功能我们可以将其应用于蛋白质的分子设计、蛋白质功能的改造、疾病的基因治疗以及新型耐抗药性药物的开发与设计甚至是发现生物进化的规律等先进科研领域上。因此，蛋白质具有非常重要的研究价值。进行蛋白质性质和功能研究的前提是获得稳定的蛋白质样品，而由于蛋白质自身性质的复杂性，难以保证获得的蛋白质样品是否具有正确的三维结构以及功能，因此急需一种技术手段或设备，对蛋白质的稳定性进行分析，确定获得蛋白质最ZUI适宜的缓冲液条件、蛋白质的长期储存稳定性等。另外在进行蛋白质-配体小分子相互作用研究时，因为需要筛选的小分子配体数量巨大，因此也急需一种技术手段或设备，可以高通量的对配体结合进行筛选。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光（350 nm/330 nm比值）的改变，获得蛋白的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。相比传统的方法，无需添加染料，通量高，样品用量少，数据精度高。  多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16是一款无需加入荧光染料、高通量、低样品消耗量检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变形剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。可应用于蛋白缓冲液条件筛选及优化、小分子与蛋白结合情况的定性测定、蛋白质修饰及改造后的稳定性测定、蛋白变/复性研究、不同批次间蛋白稳定性对比等多个方面。基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），在无需添加外源染料的条件下，对蛋白进行升温变性，通过内源荧光和散射光的变化与三级结构变化的关系，PSA-16可用于测定不同buffer中蛋白的Tm值变化，获得蛋白质正确折叠的最ZUI优buffer条件；测定不同detergent条件下膜蛋白Tm值，进行detergent筛选；测定不同添加剂对蛋白稳定性的影响；测定添加配体后Tm值变化进行配体结合筛选；测定蛋白中变性部分的比例，进行质量控制；测定蛋白Tm值与浓度的相关性，获得最ZUI优蛋白浓度进行后续结晶等实验；测定蛋白去折叠过程，进行蛋白复性条件筛选；测定蛋白folding enthalpy，研究蛋白的长期稳定性；测定不同批次和存储后的蛋白的稳定性，并进行相似性评分，对蛋白进行质量控制。多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16，无需对蛋白进行荧光标记，可以直接测定蛋白在不同缓冲液条件中的Tm值，进行缓冲液筛选和优化；同时还可以测定添加不同配体化合物对蛋白稳定性的影响，通过Tm值变化进行配体结合筛选。PSA-16满足我们目前对于蛋白质稳定性分析的迫切需求。多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16可用于评估蛋白（抗体或疫苗）热稳定性、化学稳定性、颗粒稳定性等特性，实现非标记条件下的高通量的抗体制剂筛选、分子结构相似性鉴定、物理稳定性、长期稳定性、质量控制、折叠和再折叠动力学研究等功能。★    蛋白热稳定性分析★    蛋白化学稳定性分析★    蛋白等温稳定性分析★    蛋白颗粒稳定性分析★    免标记热迁移实验（dye-free TSA）★    蛋白去折叠、再折叠、结构相似性分析★    蛋白质量控制分析 多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µg/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。★    非标记测试★    10分钟内完成16个样品的分析★    仅需10μL样品，浓度范围0.005mg/ml—200mg/ml★    15-110℃温控范围，升温速率0.1-7℃/min★    适用于任意种类的蛋白分子★    无需清洗和维护★    可增配机械手臂实现全自动工作 性能参数：★    直接检测蛋白质内源紫外荧光，测定时无需额外添加染料，不限制蛋白缓冲液。★    可同时测定16个样品。★    样品管材质：高纯度石英管，8联排设计，可使用多通道移液器批量上样，亦可单管使用。★    样品体积：15 μL/样品。★    样品浓度范围：0.01 mg/mL–250 mg/mL。★    温控范围：15-110℃可选。★    升温速度范围：0.1-15℃/分钟可调。★    温控精度：+ 0.2℃。★    采样频率：1 HZ，1/60 HZ可选。★    应用范围：热稳定性实验、化学稳定性实验、等温稳定性实验、温度循环实验、TSA实验。★    软件具备比对功能，可通过热变性曲线对蛋白进行相似性评分。★    测定参数：Tm、Ton、Cm、ΔG、Similarity。★    Tm测定精度：<0.5% CV。★    仪器使用时无需预热及预平衡，实验完成后无需清理，无后续维护费用。★    一体机，可以通过触摸屏进行试验设置，实时采集数据和显示数据，生成详细的结果报告。应用领域：多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。 1.    抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选2.    抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等3.    生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）4.    抗体偶联药物（ADC）研究5.    多结构域去折叠特性研究6.    物理和化学条件强制降解研究7.    蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）8.    膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）9.    基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）10.    蛋白纯化条件快速优化等   北京佰司特贸易有限责任公司（https://www.best-sciences.com）：类器官串联芯片培养仪-HUMIMIC；单分子质量光度计-TwoMP；灌流式细胞组织类器官代谢分析仪-IMOLA；光片显微镜-LSM-200；超高速视频级原子力显微镜-HS-AFM；蛋白质稳定性分析仪-PSA-16；全自动半导体式细胞计数仪-SOL COUNT；农药残留定量检测仪（台式）—BST-100；农药残留定量检测仪（手持式）—BST-10A；蓝光/绿光LED凝胶成像；台式原子力显微镜-ACST-AFM；微纳加工点印仪-NLP2000/DPN5000；◎ PSA-16全 多功能蛋白稳定性分析仪 缓冲液条件优化 蛋白质控 Detergent筛选 存储前后对比 蛋白改造 生产批次比对 Thermal Shift Assay 等温稳定性 AAV血清型鉴定蛋白变复性 蛋白的制备过程、存储，功能实验，都需要 合适的缓冲液条件。通过测试蛋白在不同缓 冲液中的Tm值，可以从热稳定性的角度对 缓冲液的PH值，盐浓度，添加剂(例如膜 蛋白需要的detergent)种类和浓度，制剂辅 料等进行快速筛选和优化。 Temperature Thermal Shift Assay TSA实验通量高，样品用量少，广泛用于蛋 白与配体，特别是小分子化合物的结合筛选。基于内源荧光的ifDSF方法，无需染料，不限 制蛋白类型和缓冲液成分，操作简单，数据 易于分析；可用于化合物药物结合筛选，蛋 白配体结合验证等。 Temperature 蛋白改造 某些蛋白的天然构象极不稳定，非常不利于 体外制备，功能研究，结构解析。因此在不 改变蛋白功能的前提下，可以通过对柔性区 域的截短，删除或替换，引入点突变等方法 增加蛋白稳定性。通过测试不同突变体的Tm 值，可以对突变体进行稳定性评估和筛选。 蛋白质控 无论是自己纯化的蛋白还是商业化购买的蛋 白，不同批次之间都可能存在差异。蛋白在 存储一段时间之后，和新鲜制备的样品间也 可能发生差异。对蛋白进行多次冻融等处理 后，也会改变蛋白的性质。通过对比蛋白的 热变性曲线，即可对蛋白进行质量比对。 Temperature 等温稳定性 通过将蛋白维持在某个的温度下进行长时间 荧光检测，进行加速稳定测试，即可了解蛋 白的长期稳定性。样品管进行封闭后，可保 证蛋白溶液不会挥发，完成长达数十小时的 持续检测。 Time 蛋白变复性 有些蛋白变性之后无法复性；而有些蛋白 在特定的缓冲液条件和温度下，发生部分 变性之后，随着温度的下降还会复性。研 究蛋白的复性缓冲液条件和最高可复性温 度，对于深入理解蛋白的稳定性和长期储 存条件，具有重要意义。 Time 蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与 所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶 剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350nm。 内源差示扫描荧光技术 (intrinsic fluorescence DSF)，通过检测温度变化/变性剂浓 度变化过程中蛋白内源紫外荧光(350 nm/330nm比值)的改变，获得蛋白的热稳 定性(Tm值)、化学稳定性(Cm值)等参数。相比传统的方法，无需添加染料，通量 高，样品用量少，数据精度高。 性能指标 具体参数 检测通道 330 nm 和 350 nm 紫外荧光 样品数量 16 样品体积 15 uL 样品浓度 0.01 mg/mL-300 mg/mL 温控范围 15-110℃ 升温速度 0.1-15℃/分钟 数据采集 每个样品1分钟60个数据点 数据精度 Tm值 CV<0.5% 主要应用 热稳定性，化学稳定性，等温实验，温度循环， Thermal Shift实验