离子交换是温和条件下分离蛋白质混合物的一个非常有用的技术,最常见的是应用增
加盐浓度的缓梯度溶液进行洗脱。pH 梯度洗脱使用频率较低(除专属应用外,例如色谱聚
焦),并且需要复杂的缓冲液体系。尽管如此,如今的四元液相色谱系统完全能够利用常
规缓冲盐实现 pH 梯度洗脱。本篇应用报告中,我们展示了 pH 梯度洗脱在分离单克隆抗体带电异构体时的优势。本文的工作使用了 Agilent Bio mAb 色谱柱、安捷伦 1260 Infinity生物惰性四元液相色谱系统和安捷伦缓冲液顾问软件。
蛋白质是复杂的生物分子,含有无数的带有酸性和碱性侧链官能
团的氨基酸。这些官能团的范围从羧酸类(天冬氨酸和谷氨酸)
和酚类(酪氨酸)到胺类(赖氨酸和组氨酸)和胍类(精氨酸),
还包括其他中性或疏水性残基。在给定的 pH 条件下,蛋白质将带
有一定电荷(除了等电点处净电荷为 0 外),并且可以与带有相反
电荷的吸附剂发生作用。因此,碱性蛋白质将在阳离子交换色谱
柱上获得保留。
常规的离子交换方法使用增加离子强度(盐浓度)的方法进行洗
脱,从而盐离子与蛋白质和吸附剂进行竞争吸附并最终使蛋白质
分子从色谱柱上洗脱下来。然而,pH 梯度也可用于该类洗脱。对于
阳离子交换色谱,增加 pH 使得蛋白质变成中性或带上负电荷,从
而可以从色谱柱上洗脱下来。
随着更多复杂的蛋白质被用于研究和分析,这种方法开始受到更
多的重视,复杂蛋白质如单克隆抗体,生物制备过程细微的变化
即可能导致带电变体的产生。这些细微差异包括 C 端赖氨酸的丢失、
脱酰胺基作用和唾液酸化作用(使分子酸性更强)、或者形成琥珀
酰亚胺和羧酸侧链的酰胺化(使分子碱性更强)等,如图 1 所示。
本文中我们展示了用于分离单克隆抗体带电变体的 pH 梯度方法,
该分离用传统的缓冲盐梯度洗脱时难以达到分离的效果。
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