治疗性蛋白药物制剂中吐温80（聚山梨酯 80）和泊洛沙姆188检测方案(液相色谱仪)

应用简报 Agilent制药与生物制药Trusted Answers 采用 Agilent 1290 Infinity II ELSD 同时定量分析治疗性蛋白药物制剂中吐温80(聚山梨酯80)和泊洛沙姆188 张婷婷，鲁锐，杨新磊安捷伦科技有限公司 本文介绍了利用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱系统和 Agilent 1290 Infinity IIELSD检测器对生物制剂中吐温80和泊洛沙姆188同时进行定量分析的方法。该方法采用含1%乙酸的水和异丙醇溶液为流动相，以梯度条件对生物制剂中吐温80和泊洛沙姆188同时进行分离和定量分析。该方法不需要复杂前处理过程，操作方便，分离度好，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，为生物制药企业测定生物制剂中吐温80和泊洛沙姆188提供一种可选的解决方案。 生物制药的产品比起小分子化药，结构更加复杂，异质性更高，为了保证终产品的有效性、稳定性和安全性，经常会在制剂中添加各种辅料，吐温80(聚山梨酯80， Polysorbate 80)和吐温20(聚山梨酯20， Polysorbate 20)属于非离子表面活性剂，对药物有较好的助溶作用，抑制抗体类蛋白大分子的自动聚合，可提高制剂的稳定性。泊洛沙姆 188 (Poloxamer 188，F 68)是一类新型的高分子非离子表面活性剂，具有很高的安全性，无抗原性，生物相容性好，可以作为乳化剂和稳定剂添加到制剂中以保证治疗性蛋白药物的稳定性。 目前已经上市的单抗制剂，配方中含吐温80、吐温20或P188占到80%以上。对于这些表面活性剂的分析，有一些参考方法，2020版中国药典将吐温80衍生后用比色法进行测定，其他文献采用高效液相色谱 (HPLC) 连接不同的检测器 ELSD、CAD和MS4来实现分离和测定，安捷伦在之前的应用案例中也分享了吐温20或P1885的分析方法。 本文在以往分析方法基础上，建立了一种同时分析蛋白药物制剂中吐温80和P188 的HPLC-ELSD 方法，蛋白制剂经过简单前处理后直接进样，其中的吐温80和P188即乎得到很好分离并进行准确的定量分析。 试剂和样品 吐温80购自南京威尔药业股份有限公司(注射级)；泊洛沙姆188购自Merck (药用级辅料)；乙酸为 HPLC级， 异丙醇为 HPLC级，购自上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈为 HPLC级，购自 J.T.Baker 公司(美国)。高纯水来自 Milli-Q纯水系统(美国)现制备。含吐温80和泊洛沙姆188的蛋白制剂由生物制药厂家提供。 仪器和设备 ( 采用最高耐压达800 bar 的 Agilent 1260 Infinity Prime 四元液相 色谱系统，由以下模块组成： ) ( -A Agilen t 1260 Infini t y II Flexible Pump 四元梯 度 泵(部件号 G7104C) ) ( -A Agilent 1260 Infinity II Multisampler 自动进样 器 (部件号 G7167A) ) ( -A Agilent 1260 Infinity MCT 柱温箱(部件号G7116A) ) ( -A Agilen t 1290 Infi n ity II ELSD 蒸发光散射检测器 ( (部件号 G7102A) ) ( 利用 Agilent OpenLab CDS 2.4软件进行仪器控制和数据 分析。 ) HPLC-ELSD 色谱条件 色谱柱： 纳谱分析， ChromCore SAA， 4.6 mmx150 mm，5um， 部件号 S014-050018-04615S 柱温： 30°℃ 进样量： 10pL 流速：1.2mL/min 检测器： ELSD 雾化温度： 55°℃ 蒸发温度： 65°C 气体流速： 1.60SLM 流动相A： 1%乙酸水溶液 流动相B： 1%乙酸异丙醇溶液 梯度程序： 时间(min) B(%) 校准曲线绘制 利用在一定浓度范围的几个吐温80校准标样(或P188))，将各浓度下的平均峰面积对分析物浓度作图，得到各各的校准曲线。 样品前处理 分别取待测样品溶液(含吐温80和P188的蛋白制剂样品、含吐温 80的抗体类蛋白制剂)1.0 mL到离心管中，静置一段时间后高速离心 (13200 r/min， 5 min)；取上清液，直接进样分析。 结果与讨论 色谱柱选择 吐温 80和P188都是非离子表面活性剂，由于他们本身结构的特殊性，刚刚始参考文献2选择混合基质的色谱柱 Oasis MAX(20 mm x 2.1 mm，30 pm)， 吐温80在P188出峰位置有提前流出的问题(图2)。考虑到纳谱分析的ChromCore SAA 表面活性剂专用柱(4.6 mmx150 mm， 5 pm) 色谱柱具有类似的混合分离机理，且柱容量比较高，选择该色谱柱进行吐温80和P188分离，通过优化洗脱 P 188的梯度条件可知，随着流动相中异丙醇比例的提高，P 188的峰形更好，灵敏度更高(图3)，但过高的异丙醇比例会引起吐温80的提前洗脱，综合考虑选择34%异丙醇作为 P188洗脱的最佳条件。如果单独分析P188含量，可适当提高异丙醇梯度比例，以得到更高的分离柱效(图4)。 图2.吐温80和P188分离图谱 图3.流动相中不同异丙醇比例对P188分离的影响 (32.6%和34%B) ×102 图4.流动相中不同异丙醇比例对P188分离的影响(34%、36%和38%B) 保留时间和峰面积的精密度 如表1所示，吐温80和P 188重复进样5次得到的平均保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD) 值。吐温80 的保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.06%和1.38%， P188的保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.10%和1.02%，表明该方法具有出色的稳定性和系统精密度。 表1.吐温80和P188的保留时间和峰面积的精密度(n=5) 化合物 项目 1 2 3 4 5 RSD 吐温80 保留时间(min) 4.474 4.473 4.480 4.474 4.473 0.06% 峰面积 556.559 540.211 537.219 545.3 541.43 1.38% P 188 保留时间(min) 2.795 2.798 2.798 2.803 2.798 0.10% 峰面积 138.603 142.249 140.74 140.189 141.798 1.02% 检测限和定量限 将信噪比(S/N)>3时的最低浓度定义为 LOD， 将 S/N> 10时的浓度定义为 LOQ。由此计算出的吐温80 的 LOD 和 LOQ分别为 5 pg/mL 和 10 pg/mL。当吐温80进样浓度为 10 pg/mL 且进样量为 10 uL时， S/N 达到43，远远高于 S/N > 10的要求(如图5所示)。P 188的 LOD 和 LOQ分别为 5 ug/mL 和 10 g/mL。当P188进样浓度为 10 pg/mL 且进样量为 10 pL 时， S/N 达到25， 远远高于 S/N > 10的要求(如图6所示)。这表明采用HPLC-ELSD 方法的灵敏度很高，可以满足客户分析生物制剂中低浓度吐温80和P188含量的要求。 图5.浓度为 10 pg/mL的吐温80色谱图(LOQ) 图6.浓度为10 pg/mL 的 P188色谱图 (LOQ) 线性 使用峰面积的对数与吐温80浓度的对数绘制校准曲线，在10-200 pg/mL 浓度范围内，标准曲线方程 Log(y)= 1.47Log(x)+4.80，相关系数(r)为0.9995；相同方法， P188在10-1000 pg/mL浓度范围内，标准曲线方程 Log(y)=1.53Log(x)+4.25，相关系数(r)为0.9993。表明该方法在各自浓度范围内均具有良好的线性。 图8.P188的标准曲线(浓度范围10-1000 pg/mL) 实际样品分析 在实际生物制剂分析时，采用含1%乙酸的水和异丙醇作为流动相进行梯度洗脱，制剂中蛋白大分子和缓冲盐等没有保留在死时间洗脱， P188在34%的有机相条件下洗脱，而吐温80 在100%有机相洗脱，各化合物之间分离度好，且实际样品中吐温80和P 188 的测定值在理论值的±10%范围内，说明该方法可对生物制剂中的两种辅料同时进行准确定量分析(图9和图10)。 考虑到高浓度蛋白溶液容易污染色谱柱和 ELSD 检测器，一般建议在进样之前进行除蛋白的操作，尽量降低样品溶液中蛋白的含量，减轻色谱柱分离的压力；或者在色谱柱后加装自动阀切换装置，降低对检测器的污染，保持系统的长期稳定性。 图9.实际蛋白制剂溶液中吐温80和P188分离色谱图 图 10.实际抗体类蛋白制剂溶液中吐温80的分离色谱图 结论 参考文献资料，建立了一种对治疗性蛋白药物制剂中吐温80和P188同时进行高效分离和准确定量的方法。该方法采用 Agilent1260 Infinity ll四元液相色谱系统和1290 Infinity II ELSD 检测器。1290 Infinity II ELSD 为吐温80和P188提供了较高的检测灵敏度和较好的精密度结果。吐温80和P188 的LOD 和 LOQ分别为 5 ug/mL 和 10 ug/mL， 在各自的浓度范围内均表现出良好的线性，且实际样品的测定值在理论值的±10%范围内，表明该方法可以实现准确定量分析。本方法既可以作为吐温80和P188同时分离定量的方法，也可以同时分离吐温20和P188，为生物制药的辅料分析提供更多的分析思路。 ( 1.国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版[S].四部. 北京：中国医药科技出版社，20 2 0：303 ) ( 2. Daniel H.； Taylor Z.； Yung-Hsiang K . Quantitation of polysorbate20 in protein solutions using mixed-mode chromatographyand evaporative light scattering detection. J ournal o f Chromatography A. 2008， 1215：156-160 ) ( 3.Yi L.；Daniel H .； Yvonne K. Junyan A.； Taylor Y.； Ke l lyZ. Characterization and Stability Study of Polysorbate20 in Therapeutic Monoclonal Antibody Formulationby Multidimensional U ltrahigh-Performance LiquidChromatography-Charged Aerosol Detection-MassSpectrometry.Analytical Chemistry.2014， 86：5150-5157 ) ( 4.Szabolcs F.； Katalin G.； Jeno F. Simultaneous determinationof polysorbate 20 and unbound polyethylene-glycol in pr o teinsolutions using new core-shell r eversed phase column andcondensation nucleation light scattering detection. Journal o f Chromatography A. 2010， 1217：6258-6266 ) 5.5张婷婷；杨新磊；鲁锐.使用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD) 对生物制剂中的泊洛沙姆188进行定量分析， 安捷伦科技公司应用简报，出版号：5994-1795ZHCN，2020 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2021 ) 本文介绍了利用 Agilent 1260 Infinity Ⅱ Prime 液相色谱系统和 Agilent 1290 Infinity ⅡELSD 检测器对生物制剂中吐温 80 和泊洛沙姆 188 同时进行定量分析的方法。该方法采用含1% 乙酸的水和异丙醇溶液为流动相，以梯度条件对生物制剂中吐温 80 和泊洛沙姆 188 同时进行分离和定量分析。该方法不需要复杂前处理过程，操作方便，分离度好，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，为生物制药企业测定生物制剂中吐温 80 和泊洛沙姆 188 提供一种可选的解决方案