Enbrel O-糖链中鉴定检测方案(液质联用仪)

thermoscientific 基于Q Exactive高分辨质谱仪的Enbrel O-糖链的鉴定 陈兵赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： QExactive； Enbrel； O-糖链； BlotGlycoTM O-Glycan样品制备试剂盒 融合蛋白 Enbrel (Etanercept) 是由人的肿瘤坏死因子(TNF， Tumornecrosis factor) 膜外受体部分和人的免疫球蛋白(IgG1)的 Fc 部分融合而成，包含3个N糖基化位点和13个潜在的O糖基化位点，是一种人源TTNF-a受体抗体融合蛋白，是肿瘤坏死因子(TNF-a)的拮抗剂。Enbrel通过抑制 TNF-a可以起到控制炎症、阻断病情进展的作用，它属于DMARD类药物，可用于治疗活动性类风湿关节炎、牛皮癣及关节性牛皮癣、幼年特发性关节炎、及活动性强直性脊柱炎。 糖基化作为糖蛋白生物制品的关键质量属性之一，糖基化的类型和程度对生物制品的有效性和免疫原性有重要影响。BlotGlycoTM O-Glycan样品制备试剂盒用于糖蛋白O-型糖链样品制备，图1为其商品示意图。BlotGlycoTM O-Glycan样品制备试剂盒操作主要分2步，第一步将O型糖链从糖蛋白上释放下来，而N型糖链不受到本试剂影响而分离；第二步为O型糖链的纯化和2AB标记。BlotGlycoTM 微粒捕捉第一步释放的游离O型糖链，其原理是利用糖链与微粒上的化学键结合(形成席夫碱)，而达到精制分离纯化的目的。此方法因为只与糖链结合，故可完全排除样品里含有的肽或是表面活性剂等杂质，从而纯化出高纯度糖链使接下来的分析更准确，操作流程详见图2。 本实验建立了基于BlotGlycoTM样品前处理和Q Exactive高分辨率质谱的O型糖链分析流程，为O-型糖链的测定提供快速、准确的分析方法。 图1. BlotGlycoTM O-Glycan样品制备试剂盒商品示意图 2.实验部分 2.1仪器和试剂 质谱仪器： QExactive (赛默飞世尔科技，美国)； 色谱仪器：U3000液相色谱系统(赛默飞世尔科技，美国)；色谱柱： GlycanPac AXH， 1.9 pm，2.1x150 mm； 试剂：二二次去离子水，乙腈(质谱级)，甲酸铵(质谱级)。 2.2仪器方法 色谱分析条件：具体见表1； 质谱分析条件：具体见表2； 2.3数据分析方法 Thermo Xcalibur Qual Brower定性浏览器 表1. Enbrel O-糖链的色谱分析条件 流动相 A：乙青 B： 100mM甲酸铵(pH4.4) 流速 0.4 mL/min 柱温 40℃ 荧光检测器 激发光波长330 nm/发射光波长420 nm 时间/min B相浓度/% 色谱梯度 0 15 30 30 表2. Enbrel O-糖链的质谱分析条件 扫描模式 负离子 喷雾电压 3.3kV 毛细管加热温度 320℃ S-lens 50% 鞘气流速 40 (arb) 辅助气流速 10 (arb) 质量扫描范围 m/z 200-2000 分辨率 140，000 @m/z 200 3.结果与讨论 本次实验使用Thermo GlycanPac AXH色谱柱，按表1的色谱梯度对2AB标记的Enbrel O-糖链进行分离，同时用荧光检测器和QExactive高分辨质谱仪进行检测，它们的参数详见表2。 本次实验鉴定到3种2AB标记的Enbrel O-糖链，对应的糖型为(Hex1) (NeuAc1)， (Hex1) (NexNAc1)(NeuAc1)和(Hex1)(NexNAc1)(NeuAc2)，其中(Hex1)(NeuAc1)为解离产物。根据荧光强度计算(Hex1) (NeuAc1)、(Hex1) (NexNAc1)(NeuAc1)和(Hex1) (NexNAc1)((NeuAc2)三种糖型所占比例分别为35.4%、54.0%和10.6%。质谱检测结果中各糖型实测质量与理论质量相比，质量偏差都在3 ppm以内。鉴定到的En-brel O-糖链的详细信息见表3。2AB标记后O-糖链可以用荧光检测器进行检测并且能够增强其质谱的信号响应，2AB标记的Enbrel O-糖链的荧光色谱图和(Hex1) (NeuAc1)， (Hex1)(NexNAc1) (NeuAc1)和 (Hex1) (NexNAc1) (NeuAc2)糖链的提取离子质谱图见图3。 表3.鉴定到的EnbrelO-糖链 编 保留 质量号糖型 理论质量 测时得质量间 峰面积 百分比 偏差[M-H M-H min ppm 1 (Hex1) (NeuAc1) 3.33 4.77E+05 35.4% 590.2203 590.2217 2.4 (Hex1) (NexNAc1)24.94 7.28E+0554.0% 793.2996 .793.3009 1.6 (NeuAc1) 图3.荧光检测色谱图和3种2AB标记O糖链的提取离子质谱图 4.结论 本实验采用Q Exactive高分辨质谱仪测定BlotGlycoTM O-Glycan样品制备试剂盒制备的2AB标记的Enbrel O糖链，建立了Q Ex-active分析糖蛋白O-糖链的样品前处理、色谱和质谱分析方法，为糖蛋白O-糖链的研发和生产检测提供快速、准确的分析平台。 SCIENTIFIC 电话ww.thermofisher.com 融合蛋白 Enbrel (Etanercept) 是由人的肿瘤坏死因子（TNF，Tumornecrosis factor）膜外受体部分和人的免疫球蛋白（IgG1）的 Fc 部分融合而成，包含3个N糖基化位点和13个潜在的O糖基化位点，是一种人源 TNF-α受体抗体融合蛋白，是肿瘤坏死因子（TNF-α）的拮抗剂。Enbrel通过抑制 TNF-α可以起到控制炎症、阻断病情进展的作用，它属于DMARD类药物，可用于治疗活动性类风湿关节炎、牛皮癣及关节性牛皮癣、幼年特发性关节炎、及活动性强直性脊柱炎。本实验采用Q Exactive高分辨质谱仪测定BlotGlycoTM O-Glycan样品制备试剂盒制备的2AB标记的Enbrel O糖链，建立了Q Ex-active分析糖蛋白O-糖链的样品前处理、色谱和质谱分析方法，为糖蛋白O-糖链的研发和生产检测提供快速、准确的分析平台。