人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸（钠型）检测方案(氨基酸分析仪)

SSL-CA22-173Excellence in Science Excellence in ScienceLC-298 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 使用氨基酸分析仪检测人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中的19种氨基酸(钠型) LC-298 摘要： 《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法：((YY/T 1695-2020)》于2021年4月1日实施，其中第一法为氨基酸分析仪法去(仲裁法)，本文使用岛津氨基酸分析仪建立了人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中19种氨基酸的检测方法(钠型)。采用外标法定量，实验结果显示，19种氨基酸线性良好，相关系数均大于0.999，空白样品中无干扰，各组分分离度均满足要求。以保留时间和峰面积计算方法的精密度，RSD分别在0.01%~0.19%和0.08%~4.60%之间。 关键词：氨基酸分析仪钠型 YY/T 1695-2020 《人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法(YY/T 1695-2020)》于2020年3月31日发布，已于2021年4月1日正式实施。标准中规定了三种方法，分别为氨基酸分析仪法、高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法、高效液相色谱柱前衍生法，其中第一法-氨基酸分析仪法为仲裁方法。此标准涉及19种氨基酸，包括甘氨酸 (Gly)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸 (lle)、色氨酸 (Trp)、胱氨酸 实验部分 1.1仪器 岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA，配置信息如下： 系统控制器：CBM-20A 自动进样器： SIL-16输液泵： LC-16×3脱气机： DGU-20A5R柱温箱： CTO-16L高温反应箱： CRB-40 检测器：SPD-16 ((Cys)2)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser) 、谷氨酸(Glu)、精氨酸 (Arg)、牛磺酸(Tau)。 氨基酸分析仪中使用离子交换色谱柱将样品中不同的氨基酸分离，并以茚三酮做柱后衍生，在570 nm和440 nm 波长下测定。 本文采用钠型系统建立了方法，分析时间短，分析效率高，各组分分离度均满足要求。线性关系良好，仪器精密度优良，可用于此类样品的检测。 色谱工作站： Labsolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 色谱柱： Shim-pack Amino-Na (100×6.0mml.D.， 5 um) (SGLC， P/N： S228-18837-91) 捕氨柱：Shim-pack ISC-30 /S0504 Na (50×4.0 mm l.D.) (SGLC， P/N： S228-14206-91) 洗脱液：钠型氨基酸分析流动相试剂包 (SGLC， P/N： S228-21195-94) 流速：0.6mL/min衍生液流速：0.2mL/min柱温：60℃衍生反应温度：130℃进样体积：20uL检测波长：570 nm/440 nm 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度0%，洗脱程序见表1 表1 梯度洗脱程序 时间((min) 单元 处理命令 值 9.00 泵 B.Conc 0 13.00 泵 B.Conc 17.20 泵 B.Conc 8 17.21 泵 B.Conc 11 20.80 泵 B.Conc 11 20.81 泵 B.Conc 50 22.00 泵 B.Conc 58 22.01 泵 B.Conc 100 28.80 泵 SV(Pump A) B 29.30 泵 B.Conc 100 29.31 泵 B.Conc 0 33.00 泵 SV(Pump A) A 35.00 泵 Total Flow 0.6 36.50 泵 Total Flow 0.7 43.30 泵 Total Flow 0.7 44.00 泵 Total Flow 0.6 45.00 控制器 Stop 注： SV(PumpA)表示A泵溶剂切换阀 “值”1，中选择A和B代表不同的流动相。 1.3对照品与试样的制备 对照品溶液：配制牛磺酸和色氨酸的单标溶液，并与17种氨基酸混标混匀，除脯氨酸、胱氨酸、组氨酸与色氨酸外，用水将其余15种氨基酸稀释至2.9~1500 umol/L (脯氨酸：11.7~1500umol/L、胱氨酸：1.5~750umol/L、组氨酸与色氨酸：2.9~750 umol/L) 系列浓度，4℃冰箱保存一周。 试样制备：取培养液样品 0.5 mL， 加入0.5 mL4%磺基水杨酸，混匀后9500g离心10 min， 取0.5mL上清液加入0.5mL水，混匀后进样检测。 结果与讨论 2.1色谱图 对照品图谱见图1，除脯氨酸(Pro)采用440 nm检测，其余18种氨基酸均采用570 nm。结果显示，19种氨基酸分离度均满足要求。此方法45分钟完成一次分析，19种氨基酸在35分钟内全部出峰，分析时间短，分析效率高。 图1 对照品((胱氨酸与色氨酸浓度为23.4uM， 其他46.9uM)色谱图 2.2线性 取系列浓度对照品溶液进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法拟合校准曲线，部分氨基酸校准曲线如图2所示。校准曲线线性关系良好，相关系数均大于0.999。线性方程、相关系数结果见表2。 图2 部分校准曲线 表2 线性结果 序号 氨基酸名称 简称 标准曲线 线性范围 (umol/L) 相关系数 R 准确度 % 1 牛磺酸 Tau Y=(8151.67)X+(313.537) 2.9~1500 0.9999 97.7~103.5 2 天冬氨酸 Asp Y=(18243.0)X+(-3832.26) 2.9~1500 0.9999 98.8~102.2 3 苏氨酸 Thr Y=(20724.1)X+(-10315.6) 2.9~1500 0.9999 98.3~102.5 4 丝氨酸 Ser Y=(19648.2)X+(-4947.88) 2.9~1500 0.9999 98.1~103.2 5 谷氨酸 Glu Y=(21518.3)X+(-13914.4) 2.9~1500 0.9999 97.4~104.1 6 脯氨酸 Pro Y= (5101.08)X+(1390.49) 11.7~1500 0.9998 93.7~104.6 7 甘氨酸 Gly Y=(26504.1)X+(-23519.6) 2.9~1500 0.9999 93.5~109.4 8 丙氨酸 Ala Y=(17326.6)X+(-13500.6) 2.9~1500 0.9999 95.9~109.3 9 胱氨酸 (Cys)2 Y=(26276.2)X+(8962.85) 1.5~750 0.9999 96.4~108.7 10 缬氨酸 Val Y=(18039.6)X+(3277.93) 2.9~1500 0.9999 96.7~104.1 11 甲硫氨酸 Met Y=(22906.8)X+(-7216.73) 2.9~1500 0.9999 97.8~105.2 12 异亮氨酸 ILE Y=(18845.8)X+(-3169.99) 2.9~1500 0.9999 95.8~106.2 13 亮氨酸 Leu Y=(23483.9)X+ (530.466) 2.9~1500 0.9999 98.1~101.3 14 酪氨酸 Tyr Y=(23957.4)X+(-11914.5) 2.9~1500 0.9999 97.8~107.8 15 苯丙氨酸 Phe Y=(23009.5)X+(1859.97) 2.9~1500 0.9999 96.1~105.0 16 组氨酸 His Y=(19298.5)X+(-28552.8) 2.9~750 0.9999 97.9~103.4 17 赖氨酸 Lys Y=(17172.8)X+(-8562.03) 2.9~1500 0.9999 97.4~105.6 18 色氨酸 Trp Y=(13799.0)X+(-7323.11) 2.9~750 0.9999 97.3~104.6 19 精氨酸 Arg Y=(10630.7)X+(-8475.72) 2.9~1500 0.9999 94.7~113.6 2.3精密度 取低(胱氨酸和色氨酸为23.438 umol/L， 其余46.875 umol/L)、高(胱氨酸和色氨酸为187.5 umol/L，其余375 umol/L) 两个浓度对照品溶液，连续进样测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的相对标准偏差如表3所示， RSD 分别在0.01%~0.19%和0.08%~4.60%之间，仪器精密度良好。 表3 保留时间和峰面积精密度结果(n=6) 序号 氨基酸名称 低浓度 高浓度 保留时间 (RSD%) 峰面积(RSD%) 保留时间(RSD%) 峰面积(RSD%) 1 Tau 0.11 0.45 0.09 0.23 2 Asp 0.09 0.27 0.19 0.11 3 Thr 0.07 0.22 0.12 0.16 4 Ser 0.07 0.13 0.11 0.12 5 Glu 0.08 0.33 0.11 0.10 6 Pro 0.08 4.60 0.09 1.27 7 0.03 0.76 0.06 0.14 8 0.03 0.65 0.05 0.25 9 (Cys)2 0.05 0.50 0.04 0.09 10 Val 0.04 0.38 0.04 0.18 11 Met 0.04 0.76 0.04 0.27 12 ILE 0.04 0.48 0.05 0.15 13 Leu 0.03 0.29 0.04 0.14 14 Tyr 0.03 1.01 0.03 0.18 15 Phe 0.03 0.47 0.01 0.08 16 0.02 0.46 0.01 0.11 17 0.02 0.57 0.02 0.14 18 0.02 2.74 0.01 0.45 19 0.01 1.07 0.01 0.24 2.4样品测定及加标回收率 取培养液样品照1.3节处理，进样测定，并在样品中加入低(胱氨酸和色氨酸为23.438 umol/L，其余46.875 umol/L)、高(胱氨酸和色氨酸为 187.5 umol/L， 其余375 umol/L) 两浓度19种氨基酸混标，进样测则，计算加标回收率。 样品测定及加标回收率具体结果如表4所示，样品的加标回收率在98.59~108.38%之间，表明该方法准确度良好。 表4 样品测定及加标回收率结果 序号 氨基酸名称 样品浓度 添加浓度- 加标样品- 回收率-低 添加浓度- 加标样品- 回收率-高 (umol/L) 低(umol/L) 低(umol/L) (%) 高(umol/L) 高 (umol/L) (%) 1 Tau N.D. 46.875 47.847 102.07 375.000 392.893 104.77 2 Asp 3.191 46.875 50.695 101.34 375.000 397.072 105.03 3 Thr 7.807 46.875 55.398 101.53 375.000 402.723 105.31 4 Ser 8.544 46.875 55.833 100.88 375.000 403.423 105.30 5 Glu 22.785 46.875 68.998 98.59 375.000 416.105 104.89 6 Pro 8.885 46.875 58.618 106.10 375.000 397.310 103.58 7 Gly 9.861 46.875 56.964 100.49 375.000 406.880 105.87 8 Ala 32.856 46.875 79.666 99.86 375.000 428.875 105.61 9 (Cys)2 N.D. 23.438 23.586 100.63 187.500 198.552 105.89 10 Val 12.785 46.875 60.247 101.25 375.000 411.166 106.23 11 Met 1.908 46.875 50.712 104.12 375.000 408.335 108.38 12 lLE 3.571 46.875 50.251 99.58 375.000 397.004 104.92 13 18.572 46.875 65.525 100.17 375.000 412.847 105.14 14 4.630 46.875 51.393 99.76 375.000 398.203 104.95 15 Phe 7.260 46.875 54.141 100.01 375.000 402.576 105.42 16 5.878 46.875 53.405 101.39 375.000 402.109 105.66 17 12.983 46.875 59.327 98.87 375.000 399.880 103.17 18 2.158 23.438 25.878 101.21 187.500 199.682 105.35 19 6.106 46.875 53.250 100.57 375.000 392.416 103.02 N.D.： 未检出 结论 为应对YY/T 1695-2020标准的实施，立足于岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA 新产品，本文建立了钠型体系的氨基酸分析仪法用于人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中19种氨基酸的含量测定。该方法准确可靠，各项指标均满足标准要求，可用于此类医疗器械的检测。 岛津应用云 为应对YY/T 1695-2020标准的实施，立足于岛津氨基酸分析仪LC-16AAA新产品，本文建立了钠型体系的氨基酸分析仪法用于人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中19种氨基酸的含量测定。该方法具有准确可靠，各项指标均满足标准要求，可用于此类医疗器械的检测。