饲料中四环素类抗生素检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2021 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中4种四环素类抗生素 全自动固相萃取；全自动氮吹浓缩仪；高效液相色谱-中联质谱法；叫环素；；饲料 小文参考《农业农村部公告第282号-2-2020饲料中土霉索、四环素、金霉素、多西环素的测定》 ，试样采用EDTA-MCLLVAINE缓冲液提取，经睿科RAYKOL FOTECTOR PLUS全自动固相萃取仪净化，洗脱液经夜科RAYKOL EVA 80全云动氮吹浓缩仪吹干，30%甲醇水溶液复溶，高效液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。添加上机浓度为10 NG/ML的加标实验，得到4种化合物的加标回收率在71%-81%之间， RSD值小丁10%，表明该方法准确度高、精密度好，，可以满足饲料中四环索类抗生素的检测需求。 全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中4种四环素类抗生素 1.介绍 四环素类抗生素(图-1)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，由于实用性高且价格低廉，在畜禽养殖和饲料添加剂等方面得到了广泛的应用。近年来，我国畜牧业发展迅速，动物疾病越来越复杂，兽药和饲料添加剂的使用量也日渐增加。饲料中添加过量的兽药如四环素类抗生素是导致肉、蛋、奶等动物源性食品中残留物超标的重要原因，从而对身体健康造成危害。因此对饲料中四环素类药物残留的检测就显得尤为重要。 图-1.四种四环素类抗生素结构图 本文参考《农业农村部公告第282号-2-2020饲料中土霉素、四环素、金霉素、多西环素的测定》，试样采用 EDTA-Mcllvaine 缓冲液提取，经睿科 Raykol Fotector Plus全自动固相萃取仪净化，洗脱液经睿科 Raykol EVA 80 全自动氮吹浓缩仪吹干，30%甲醇水溶液复溶，高效液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。添加上机浓度为 10 ng/mL 的加标实验，得到4种化合物的加标回收率在 71%-81%之间， RSD 值小于10%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中四环素类抗生素的检测需求。 关键字：全自动固相萃取；；全自动氮吹浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱法；；四环素；；饲料 2.仪器和耗材 全自动固相萃取仪：睿科 Raykol Fotector Plus 全自动氮吹浓缩仪：： 睿科 Raykol EVA 80 高效液相色谱-串联质谱仪： Agilent 1260+6410 HLB固相萃取柱 (RayCure， 60mg/3mL， 货号： RC-204-36473)。 甲醇(优级纯)，磷酸氢二钠(优级纯)，柠檬酸(优级纯)，浓盐酸(分析纯)，超纯水10%甲醇水溶液：量取10mL甲醇用超纯水定容至100mL。 30%甲醇水溶液：量取30 mL 甲醇用超纯水定容至100mL。 Na2EDTA-McIlvaine(0.1 mol/L)缓冲溶液(pH=4.0)：准确60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8g和柠檬酸21.0g与烧杯中，加入1000 mL的纯净水，加入浓盐酸调节 pH 值至4.0。 3.样品前处理 3.1提取 称取2g饲料试样置于50 mL离心管中，加入0.1 mol/LNa2EDTA-McIlvaine缓冲液20 mL，涡旋混合后振荡 10 min， 超声提取 10 min， 以10000 r/min 离心10 min，转移上清液至50 mL容量瓶。残渣再用20 mL、10 mL 缓冲液提取2次，合并3次上清液，混匀，用缓冲液定容至50mL。准确移取 2 mL 提取液至 20 mL玻璃上样管中，待净化。 3.2 净化与浓缩 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 HLB柱 (RayCure， 60mg/3mL) 活化 甲醇，超纯水， EDTA-Mcllvaine缓冲液 淋洗 水，10%甲醇水溶液 洗脱 甲醇 分别以3mL甲醇、3 mL水和3mL EDTA-Mcllvaine 缓冲液活化 HLB 柱，将上述2 mL提取液以1 mL/min 的速度进行上样，并用3 mL 水清洗样品瓶，3 mL 10%甲醇水对固相萃取柱进行淋洗。用气推将柱子压干，最后以5 mL 甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图-2)。将洗脱液用 Raykol EVA-80 全自动氮吹浓缩仪于40℃条件下浓缩至干，用30%甲醇水溶液定容至1mL，涡旋混匀，过滤膜上机检测。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间\min 1 清洗样品通道 甲醇 2.8 2 活化 甲醇 有机废液 2 3 1.9 3 活化 水 废水 2 3 1.9 4 活化 EDTA-Mcllvaine缓冲液 废水 2 3 1.9 5 上样 废水 1 3 3.5 6 清洗样品瓶 水 废水 60 3 3.8 7 淋洗 10%甲醇水 有机废液 2 3 1.9 8 气推 有机废液 80 30 2.2 9 清洗注射泵 甲醇 60 5 0.5 10 洗脱 甲醇 收集 1 5 5.4 11 气推 收集 20 10 1.3 12 结束 13 图-2 Fotector Plus 饲料四环素固相萃取方法 4.检测条件 4.1色谱-质谱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5umx2.1 mmx50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A：10mM ammonium acetic(0.1% formic acid)，B： Methanol 柱温 35°C 进样体积 10 uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-0.50 min， 80%流动相A； 0.50-2.0 min， 30%流动相A； 2.0-4.0min，30%流动相A； 4.00-4.10 min， 90%流动相A； 4.10-7.0min，90%流动相A。 4.2 MRM 参数 表-2.4种四环素的串联质谱检测参数 CompoundName Precursorlon ProductIon Dwell Fragmentor CollisionEnergy Cell AcceleratorVoltage 四环素 445.2 427.1 40 120 6 7 410.1 40 120 14 7 154 40 120 26 7 土霉素 461.2 443.2 40 115 8 7 426.1 40 115 12 7 金霉素 479.2 444.1 40 120 18 7 462 40 120 12 7 强力霉素 445 428.1 40 125 14 7 321.1 40 125 30 7 267.1 40 125 38 7 4.3 MRM 质谱图 下图为四种四环素类化合物标准溶液在液质上的质谱图： 5. 加标实验 5.1基质效应验证 为消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需要用空白样品按照上述提取和净化步骤，制备空白提取液，再加入一系列浓度标准品，配制成基质加标曲线。 5.2 样品加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向空白饲料样品(2g)加入上机浓度为 10 ng/mL 的4种四环素标准品，进行上述前处理，测试结果如3所示。 表-3.添加实验的回收率及相对标准偏差(n=3) 化合物 回收率(%)样品-1 回收率(%)样品-2 回收率(%)样品-3 平均回收率(%) RSD(%) 四环素 68.7 74.5 71.3 71.5 4.1 土霉素 82.2 81.0 78.4 80.5 2.4 金霉素 70.8 74.3 78.9 74.7 5.4 强力霉素 77.4 69.3 70.5 72.4 6.1 6.总结 6.1采用睿科 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪能同步进行6个样品净化，连续自动处理60个样品，做样通量高；同时可无人值守，大幅度减少了工作人员的工作量，提高了工作效率。此外还可避免工作人员因操作失误导致的检测偏差，也可将实验人员更迭对检测结果的影响最小化。 6.2睿科 Raykol EVA 80 全自动氮吹浓缩仪处理通量高，80个样品可同时进行氮吹，实验平行性好；而且采用氮吹针自动追随液面设计，无需手动调节氮吹针高度且耗气量小，省时省力。 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 邮箱： info@raykol.com热线：址：：Vwww.raykol.com 热线：箱： info@raykol.com网址：：Vwww.raykol.com 本文参考《农业农村部公告第282号-2-2020 饲料中土霉素、四环素、金霉素、多西环素的测定》 ，试样采用EDTA-Mcllvaine缓冲液提取，经睿科Raykol Fotector Plus全自动固相萃取仪净化，洗脱液经睿科Raykol EVA 80全自动氮吹浓缩仪吹干，30%甲醇水溶液复溶，高效液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。添加上机浓度为10 ng/mL的加标实验，得到4种化合物的加标回收率在71%-81%之间，RSD值小于10%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中四环素类抗生素的检测需求。