细胞中3D打压检测方案(生物3D打印)

CELLINKLIFESCIENCES 编号：BPR-IK-3X2131日期： 2020年12月18日 作者： EP，JB，VK.版本：6 生物打印协议 GelXA LAMININK 这是一个建议的程序，请根据你的实验需要进行调整。保持产品的无菌性，在无菌条件下工作。 协议目标 该协议的目的是提供使用 INKREDIBLE、INKREDIBLE+、BIOX或 BIO X6的 GelXALAMININK 生物墨水进行生物打印的说明，有无细胞。。 GelXA LAMININK 系列包括GelXA LAMININK 111、GelXA LAMININK 121、GelXA LAMININK 411、GelXALAMININK 521 和 GelXA LAMININK+。本文件涵盖了与细胞的预打印混合、3D生物打印和离子交联或通过光固化的后打印过程。该方案针对 GelXA LAMININK 进行了优化，其中 LAP 0.25% 未稀释以及10+1细胞悬液稀释。改变 LAP 或 bioink 的浓度与细胞悬浮液的比例会改变光交联时间。参考光交联优化协议来调整和确定这些数字。该协议通过使用 BIO X和 BIO X6的温控打印头进行了优化。 所需材料 一GelXALAMININK Bioink* 交联剂*(随bioink采购一起提供) 紫外线屏蔽盒，3cC* 无菌锥形生物打印喷嘴，22-27g推荐* BioX*、BioX6*或Inkredable系列*3D Bioprinter 井板或培养皿* 用于光固化的405或365纳米光模块 细胞+细胞培养基 3毫升带Luer锁连接的注射器 阴/阴路厄锁适配器*或 细胞混合器* *产品可在CELLINK商店购买，网址为www.CELLINK.com/store/ 如果从橙色防紫外线墨盒转印，请保持生物墨水不受光影响，以避免在打印前交联。在黑暗模I式下使用3D打印机。光引发剂对反复或长时间暴露于热敏感。 协议 使用BIO X或BIO X6， 在15℃下冷却打印床，在24°℃下温控打印头时，该协议工作最佳。GelXA层状油墨也可以使用气动打印头或可喷墨系列进行挤压，但如果环境温度超过25℃且打印头发热，则形状保真度会降低。如果使用可喷墨系列，打印基材如培养皿或孔板应放置在冰上或另一个冷却的表面上，以便在打印后热凝胶结构，然后再进行光交联。 步骤 标题 材料 说明 准备生物墨水 -GelXA LAMININK 如果不使用单元格打印，则直接转到第3步。 -在墨盒/注射器中加热 GelXA LAMININK 在37°C下保持10分钟。 GelXA LAMININK 的加热可以在气动打印头、水浴或培养箱中进行。长时间和重复加热会对光引发剂的稳定性和生物墨水的均匀性产生负面影响，需要在添加细胞之前进行额外的混合。如果不在墨盒中使用整个3 mL 的 bioink， 请使用女性/女性 Luer 锁适配器将所需的量转移到注射器中，并在最佳存储条件下保留其余的 bioink. 注意：如果 bioink 中有气泡，请在1600 rpm 下快速离心1.5分钟。 2 将 GelXALAMININK与细胞混合 -细胞悬液-细胞混合器 -母/母鲁尔锁适配器-带 Luer 锁连接的3mL 注射器-预热的 GelXA LAMININK 此时，将十份 bioink与细份细胞悬液混合，注意不要将气泡引入混合物中。有关详细说明，请参阅Mixing Cells Protocol GelX 系列。 -使用母/母 Luer 锁适配器将细胞悬浮液转移到1mL细胞注射器(第1部分)。 -使用母/母Luer 锁接头将 GelXA LAMININK 转移到 12 mL注 射器(第2部分)。 -将两个注射器夹在分配装置上(第3部分)。-将两个注射器连接到混合装置(第4部分)，然后将空药筒(第5部分)从另一侧连接到混合装置。-在分配装置上轻轻施加压力，将两个注射器的内容物混合 到空药筒中。 注意：为避免在混合 bioink 和细胞悬浮液时出现气隙，请在将注射器与细胞悬浮液连接之前小心地用 GelXA LAMININK预填充 Luer锁适配器。 如果准备 <2 mL 的 GelXA LAMININK， 建议连接两个3mL鲁尔锁注射器，并在注射器之间来回混合 bioink， 直到它变 得均匀。 2 3 冷却并装入墨盒 -紫外线屏蔽子弹，3CC 装入格尔克萨层压(及细胞) -无菌锥形生物打印喷嘴，22-27g 将墨盒放置在%1的计数器上0-20分钟到触角房间温度。如果这个生物墨水有被预热后，它罐头取而代之的是是放置在a冰箱对于3-5分钟，或在温度控制下打印头在24°℃对于5分钟数对于更快冷却。 注：房间温度是在内部 20-25°C。 将室温回火的GelXA层状油墨放入打印头和带有打印喷嘴的帽。如果使用这个生物×或生物X6，预冷这个打印床至15°℃。 注意：使用GelXA LAMININK打印时，推荐打印头温度对于这个最高打印保真度是20-25°℃，虽然这个生物墨水罐头是分配向上至32°C。 4 打印 -生物穿孔器(BIOX、BIOX6或可墨水系列)-嗯板材或 Petri 碟子 生物穿孔结构与参数根据至表1。如果打印适性不理想，请调整压力上升/下降1kPa以挤出更多/更少材料。 如果打印头在长时间打印过程中发热会议或环境温度超过25℃，生物墨水也会加热到25°C以上粘度降低，当挤出时观察到即使在低压下也有很厚的细丝。在这里面凯斯，重复台阶3至返回至这个温度范围对于好打印适性。 注意：如果挤压间隔时间过长生物墨水罐头干的在这个喷嘴造成它至木屐。如果这个发生，替换与新建喷嘴。 3 表1.使用稀释/未稀释生物油墨在20-25℃下打印连续长丝的建议最小挤压压力**(±2kPa)。。“稀释”假设一份PBS到十份bioink的混合物，这是对bioink和细胞悬浮液混合条件的模拟。对于较小的稀释度，压力需要增加到用于未稀释生物墨水的压力。 印刷速度(mm/s)喷嘴尺寸(G) 5 10 15 20 22 519 5 6 729 13 21 25 25 10 12 38 27 25 10 **这只是推荐的启动压力参考值。所需的实际压力将根据制备程序(生物墨水的量和生物墨水的实际温度)以及活塞在墨盒中的安装和打印表面的平整度而变化。该表是在打印头温度为24℃和使用PBS稀释10+1生物墨水的情况下生成的。 步骤 标题 材料 说明 5 交联 -交联剂和/或-用于光固化的405或 365nm光模块-细胞培养基 GelXA层状油墨可以使用以下方法进行光交联这个405或365纳米光模块或离子地用CaCl交联2-含交联探员。如果使用两者都有，开始与光交联。光交联仅限威尔生成a较硬结果比离子型交联只有。 光交联：参见表2下面对于推荐交联时间。确保生物打印GelXA层状连接构建体是在打印后通过冷却打印床(如果使用BIOX或BIOX6)或放置这个打印基材与这个在冰上构造10秒(如果使用可喷墨系列)。如果光交联过程中生物打印，设置这个交联参数适当地在这个G码对于这个可喷墨系列或打印头设置页面对于这个生物X或生物X6. 注意：建议使用405纳米光模块取而代之的是的365纳米一个如果有可能。过度曝光可能损坏这个细胞。 注：至验证这个交联是足够，添加37°℃媒体至一个打印嗯而且观察那个它不溶解。 离子型交联：淹没这个充满细胞的交联溶液中的结构物30秒到5分钟，具体取决于结构大小。除去交联液并冲洗构造与基础的文化媒体一次。 表2.建议的构建光交联时间***。使用BIO X或BIO X6光固化模块将每个光模块的距离设置为5厘米。如果使用可喷墨系列光固化模块，所需时间可能会减少。用其他参数交联，见光交联优化协议。该表是使用GelXA LAMININK与间充质干细胞生成的。使用细胞打印时，曝光时间不要超过120秒。为了在打印较厚的构造时达到最佳的结构完整性，建议每隔4层用365/405nm光施加3/5秒的光交联。若在25℃以上使用bioink，每隔一层用365/405nm的光进行3/5s的光交联，效果最好。 365牛米，搭接0.25% 405牛米，搭接0.25% 施工深度(mm)/时间(s) 1/5 1/10 3/20 3/30 ***这只是一个推荐的参考交联时间开始。交联所需的实际时间将根据结构物的尺寸和温度以及光固化模块的强度和到结构物的距离而变化。 台阶 标题 材料 说明 6 孵化 -细胞培养基 一 交联后，将所需介质加入构造而且地点他们在一个孵化器。 在细胞培养基中孵育构建物标准培养条件(37°C，5%CO2而且95%相对的湿度)或根据至应用程序。 5 上海迹亚国际商贸有限公司 Gaia China Co.，Ltd. 电话Tel：021-68779823 手机Mob：13818732961，18201779599 邮箱Mail： info@gaiasciencechina.com 网址Web： www.gaiachina.com.cn 地址Add：上海市浦东新区张江高科园区海趣路236号1221室 ShanghaiPudong New Area Zhangjing Hi-Tech Park，236 HaiquRoad，#1221，Shanghai 201203，China www.gaiachina.com.cn 协议目标该协议的目的是提供使用 INKREDIBLE、INKREDIBLE+、BIO X 或 BIO X6 的 GelXA LAMININK 生物墨水进行生物打印的说明，有无细胞。 GelXA LAMININK 系列包括GelXA LAMININK 111 、GelXA LAMININK 121 、GelXA LAMININK 411 、GelXALAMININK 521 和 GelXA LAMININK+。 本文件涵盖了与细胞的预打印混合、3D 生物打印和离子交联或通过光固化的后打印过程。 该方案针对 GelXA LAMININK 进行了优化，其中 LAP 0.25% 未稀释以及 10+1 细胞悬液稀释。 改变LAP 或 bioink 的浓度与细胞悬浮液的比例会改变光交联时间。 参考光交联优化协议来调整和确定这些数字。 该协议通过使用 BIO X 和 BIO X6 的温控打印头进行了优化。所需材料- GelXA LAMININK Bioink*- 交联剂*（随bioink采购一起提供）- 紫外线屏蔽盒，3cC*- 无菌锥形生物打印喷嘴，22-27g推荐*- BioX*、BioX6*或Inkredable系列*3D Bioprinter- 井板或培养皿*- 用于光固化的405或365纳米光模块- 细胞+细胞培养基- 3毫升带Luer锁连接的注射器- 阴/阴路厄锁适配器*或- 细胞混合器*