板蓝根颗粒中鸟苷、尿苷、腺苷检测方案

2020版药典方法测定结果 2020版药典板蓝根颗粒中鸟苷、尿苷、腺苷的测定 板蓝根颗粒样品基质比较复杂，按照20版药典方法测定含蔗糖和不含蔗糖两种板蓝根颗粒样品时，会发现柱寿命短，尿苷理论塔板数较低不易达到药典要求，能明显看到第一针和第二针存在理论塔板数差异，不稳定等问题。 为此，大曹技术中心尝试对柱温、流速、梯度条件进行微调，最终能够得到良好的分离结果。 2020版药典方法 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8rml；柱温为30℃，检测波长为254nm。理论板数按尿苷峰计算应不低于10000。 时间(分钟) 流动相A(%) 流动相B(%) 0~3 3 97 3~20 3-10 97--90 20~40 10→70 90--30 40~50 70 30 由于药典条件中梯度初始比例只有3%，为保证色谱柱的稳定使用，我们选择了能够在纯水系流动相中使用的 CAPCELL PAK C18 AQ S3 色谱柱进行分析。 图1含蔗糖样品分析色谱图 图2不含蔗糖样品分析色谱图 尿苷能够达到近 10min 保留时间，样品中尿苷理论塔板数分别为23440和23028，均满足药典要求的10000以上。 对于含蔗糖样品能够与基质基本分离，但在不含蔗糖样品中鸟苷附近存在基质干扰。 因此，我们尝试对柱温、流速、梯度进行微调，能够得到良好的分离结果。 温度调节 分别使用35、30(药典条件)、27、25℃进行分析比较，发现鸟苷出峰位置与前后杂质出现峰序变化，其中35℃时与后面杂质分离较好，与前面小杂质峰未得到基线分离 图3不同柱温下的对比结果 图435℃柱温下单标对比结果 流速调节 在35℃柱温下，我们尝试将流速由 0.8ml/min 调整至 0.7ml/min 后，能够达到鸟苷前后杂质能够得到分离，分离度分别为1.658和2.076。尿苷同样能够与其后杂质良好分离，分离度1.897，理论塔板数22137，满足药典大于10000的要求。 图535℃柱温下，流速由 0.8ml/min 调整至 0.7ml/min 后对比结果 梯度条件调节 在35℃柱温下，对梯度条件进行微调，将20min 处有机相比例分别设定为8%、10%(药典条件)、12%进行比较，其中在12%变化时，鸟苷前后杂质能够得到分离，分离度分别为1.652和2.009，同时尿苷与后面杂质分离度也能够达到2.005，理论塔板数21176，符合药典要求。 图6梯度调节对比结果 图7梯度调节后局部放大图 HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S3； 4.6mm i.d.×250mm 流动相：A：水B：甲醇 B% 3%(0min)->3%(3min)->12%(20min)->70%(40min)->3%(40.1min)->3%(50min) 流速：800uL/min 温度：35℃ 检测：UV254nm 进样量：5uL 样品：对照品：尿苷20pg/mL、鸟苷20ug/mL、腺苷 25ug/mL(5%甲醇溶解)样品：取1.4g样品，加入5%甲醇至10mL， 超声 5min 溶解后，10000rpm/min 离心 5min 后，过0.22um滤膜 综上所述，对于板蓝根颗粒样品的分析，可使用 CAPCELL PAK C18 AQ S3；4.6mm i.d.×250mm 色谱柱完成，尿苷的理论塔板数能够达到药典要求2倍以上，分离良好。本实验共进样30针以上，未见理论塔板数出现明显变化，稳定性良好。 此外，颗粒剂实际样品的成分复杂，特别是不含蔗糖样品中含有糊精、淀粉等不溶性辅料较多，建议在超声溶解后先进行离心后再过滤，或多次过滤直至溶液完全澄清 (0.22um滤膜).，以免微量的不溶物堵塞色谱柱筛板，造成柱效的较快下降。同时 色谱柱需定期使用高比例有机相进行冲洗。 2020版药典 板蓝根颗粒中鸟苷、尿苷、腺苷的测定 板蓝根颗粒样品基质比较复杂，按照20版药典方法测定含蔗糖和不含蔗糖两种板蓝根颗粒样品时，会发现柱寿命短，尿苷理论塔板数较低不易达到药典要求，能明显看到第一针和第二针存在理论塔板数差异，不稳定等问题。 为此，大曹技术中心尝试对柱温、流速、梯度条件进行微调，最终能够得到良好的分离结果。 2020版药典方法 由于药典条件中梯度初始比例只有3%，为保证色谱柱的稳定使用，我们选择了能够在纯水系流动相中使用的CAPCELL PAK C18 AQ S3色谱柱进行分析。 2020版药典方法测定结果图1 含蔗糖样品分析色谱图图2 不含蔗糖样品分析色谱图 尿苷能够达到近10min保留时间，样品中尿苷理论塔板数分别为23440和23028，均满足药典要求的10000以上。 对于含蔗糖样品能够与基质基本分离，但在不含蔗糖样品中鸟苷附近存在基质干扰。 因此，我们尝试对柱温、流速、梯度进行微调，能够得到良好的分离结果。 温度调节 分别使用35、30（药典条件）、27、25℃进行分析比较，发现鸟苷出峰位置与前后杂质出现峰序变化，其中35℃时与后面杂质分离较好，与前面小杂质峰未得到基线分离。 图3 不同柱温下的对比结果 图4 35℃柱温下单标对比结果 流速调节 在35℃柱温下，我们尝试将流速由0.8ml/min调整至0.7ml/min后，能够达到鸟苷前后杂质能够得到分离，分离度分别为1.658和2.076。尿苷同样能够与其后杂质良好分离，分离度1.897，理论塔板数22137，满足药典大于10000的要求。 图5 35℃柱温下，流速由0.8ml/min调整至0.7ml/min后对比结果 梯度条件调节 在35℃柱温下，对梯度条件进行微调，将20min处有机相比例分别设定为8%、10%（药典条件）、12%进行比较，其中在12%变化时，鸟苷前后杂质能够得到分离，分离度分别为1.652和2.009，同时尿苷与后面杂质分离度也能够达到2.005，理论塔板数21176，符合药典要求。 图6 梯度调节对比结果图7 梯度调节后局部放大图 HPLC Conditions色谱柱：CAPCELL PAK C18 AQ S3; 4.6mm i.d.×250mm流动相：A:水  B:甲醇           B% 3%(0min)-> 3%(3min)->12%(20min)->70%（40min)->3%（40.1min）->3%（50min）流  速：800 µL / min温  度：35°C检  测：UV 254nm进样量：5 µL样  品：对照品：尿苷20µg/mL、鸟苷20µg/mL、腺苷25µg/mL （5%甲醇溶解）样品：取1.4g样品，加入5%甲醇至10mL，超声5min溶解后，10000rpm/min离心5min后，过0.22µm滤膜 综上所述，对于板蓝根颗粒样品的分析，可使用CAPCELL PAK C18 AQ S3; 4.6mm i.d.×250mm色谱柱完成，尿苷的理论塔板数能够达到药典要求2倍以上，分离良好。本实验共进样30针以上，未见理论塔板数出现明显变化，稳定性良好。 此外，颗粒剂实际样品的成分复杂，特别是不含蔗糖样品中含有糊精、淀粉等不溶性辅料较多，建议在超声溶解后先进行离心后再过滤，或多次过滤直至溶液完全澄清（0.22µm滤膜），以免微量的不溶物堵塞色谱柱筛板，造成柱效的较快下降。同时色谱柱需定期使用高比例有机相进行冲洗。 同时，也由于中成药成分复杂，部分基质受到流动相条件影响大，在不同仪器系统上可能出现分离不同的情况（本实验室使用岛津20A二元高压泵系统），建议客户可根据仪器上的实际分离情况，进行梯度或柱温的微调，以获得更好分离结果。