行业应用 | 离子色谱在原料药及其相关制剂中的应用（2）

离子色谱在制药行业中的应用(系列一) 离子色谱在原料药及其相关制剂中的应用(2) 近年来，随着前处理方法的不断优化，新型多功能色谱柱的开发，淋洗液发生器技术的日益成熟，多种检测器联用技术的探索，离子色谱(IC)在制药行业中的应用越来越广泛。IC 适合检测一些能够溶于水，并有一定解离度的化合物，特别不易挥发、又无紫外吸收的药物，以补充液相和气相对离子型药物分析的不足。 离子色谱可用于分析药物或药物中阴离子、阳离子、有机酸、有机胺、糖类以及抗生素等多种组分，可为药物质量和安全提供科学保障。 为此，盛瀚科研人员围绕“离子色谱在制药行业中的应用”进行了一系列实验测定，希望制药行业或行业外的读者对离子色谱的应用有更多了解和参考。 一、离子色谱在原料药及其相关制剂中的应用 原料药，指用于生产各类制剂的原料，是制剂中的有效成份，由化学合成、植物提取或者生物技术所制备的各种用来作为药用的粉末、结晶、浸膏等。原料只有加工成药物制剂，才能成为供临床使用的药物，因此原料药质量好坏决定制剂质量的好坏。 世界各国对于其广泛应用的原料药及其相关制剂都制定了严格的国家药典标准和质量控制方法，以加强药物中有毒成分的控制，加强对药物杂质的定性生量研究，进一步完善药物与有效性相关的质量控制要求。 4.中药材中二氧化硫的测定 硫磺熏蒸或浸泡是中药材、饮片的传统养护方法，它能使中药材、饮片外观光鲜，即使水分严重超标也不会霉变。但这种加工方法会导致中药材原药残留大量的二氧化硫，对人体健康有一定的影响。2020版药典规定了酸碱滴定法、气相色谱法、离子色谱法用于检测中药材中二氧化硫。其中离子色谱法需使用水蒸气蒸馏法提取中药材中二氧化硫，将其转化为亚硫酸根，进一步被双氧水氧化为硫酸根后进行分析测定。 ● 分析柱： SH-G-1+SH-AC-4 ● 流动相：2.0mMNa2CO3+8.0 mM NaHCO3 ● 流速：11.3mL/min 柱温：35℃ 抑制器： SHY-A-6 ● 进样体积：25uL ● 前处理：称取5~10g供试品粗粉(准确记录质量，精确至0.0001g)，置于水蒸气蒸馏装置蒸馏，吸收液过 0.22 um 滤膜进样分析。 图1中药材中二氧化硫(SO4?-)谱图 5.达肝素钠中亚硝酸根和硫酸根离子的测定 达肝素钠为猪黏膜的低分量肝素钠，平均分子量4000~6000，为新一代抗血栓形成药，具有明显的抗血栓形成功能，尤其抗凝血第Xa因子的功能很强，但抗凝作用微弱，抗凝血酶作用极微弱。达肝素钠是由普通肝素解聚或经酶作用而获得，具有普通肝素所不具备的优点。近年的研究结果表明，其疗效高于普通肝素，具有使用方便，相对安全等优点，可在院外使用。达肝素钠常存在游离的亚硝酸根和硫酸根离子，可用离子色谱法进行定性定量分析。 (1)达肝素钠中亚硝酸根离子 ● 分析柱： SH-G-1+SH-AC-3 ● 流动相：166mMNaAc (磷酸调节 pH至4.3) ● 流速： 1.0mL/min 柱温：室温 ● 检测方式：直流安培法 ● 施加电压：1.0V 进样体积：100pL ● 前处理：准确称取固体样品 80 mg，加纯净水定容至10mL， 过 0.22 um滤膜进样分析。 图1达肝素钠中亚硝酸根离子谱图 (2)达肝素钠中硫酸根离子 ● 分析柱： SH-G-1+SH-AC-3 ● 流动相：2.0mMNa2CO3+8.0 mM NaHCO3 ● 流速：11.0mL/min ● 柱温：35℃ ● 抑制器： SHY-A-6 进样体积：25uL 图2达肝素钠中硫酸根离子谱图 6.硫酸软骨素中硫酸根离子的测定 硫酸软骨素(CS)，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。在医学上主要是作为治疗关节疾病的药品，与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效，可以从根本改善关节问题。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺聚合而成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。虽然多糖的主链结构并不复杂，但硫酸化程度、硫酸基多少是决定其活性大小的极为重要的指标。因此检测硫酸软骨素中硫酸根离子的含量，对于活性研究和临床应用重要的意义。 分析柱：SH-G-1+SH-AC-4 ● 流动相：2.0mMNa2CO3+8.0 mMNaHCO3 流速：11.3 mL/min ● 柱温：35℃ ● 抑制器：SHY-A-6 ● 进样体积：25uL ● 前处理：样品过0.22 um一次性针头过滤器进样分析。 图1硫酸软骨素中硫酸根离子谱图 7.伊班膦酸钠中亚磷酸根和磷酸根离子的测定 伊班膦酸钠(IB)，化学名称为1-羟基-3-(N-甲基-N-戊胺基)亚丙基双膦酸单钠盐一水合物。IB属于第三代双膦酸类药物，用于治疗恶性肿瘤骨转移、预防骨转移及乳腺癌骨转移后骨骼事件的发生，并可预防和治疗骨质疏松症，是目前适应症最广的双膦酸盐药物，具有高效、低毒和使用方便等优点。 随着 IB临床应用的增多，有必要建立便捷、灵敏的检测方法，为药品质量检测提供技术支持。磷酸根和亚磷酸根作为伊班膦酸钠注射液中的有关物质，分析方法主要有容量分析法、分光光度法、高效液相色谱-示差折光检测法、离子色谱法等。通常情况下，容量分析和分光光度法易受制剂中辅料干扰，现已较少应用；示差折光检测法对离子态物质灵敏度低，受流动相组成的波动影响较大，不适合梯度洗脱；离子色谱法因其其确、快速、选择性好，可同时分离多组分物质等优点被广泛应用。 ● 分析柱： Ion Pac AG11-HC+AS11-HC 流动相： KOH梯度洗脱 0-5min， 16mMKOH： 5-7 min， 16-25mM KOH；7-17 min， 25mMKOH：17-20 min， 25-45mMKOH； 20-23 min， 45mMKOH； 23.1-28 min， 25mMKOH； 28.1-39 min， 16mMKOH。 ● 流速： 1.0mL/min ● 柱温：35℃ ● 抑制器： SHY-A-6 ● 进样体积：20uL 前处理： 储备液：分别准确称取0.1048 g 亚磷酸、0.1123g伊班膦酸钠，加超纯水稀释定容至100mL， 配制得 PO33-、伊班膦酸1000 mg/L 储备液。 供试品：取伊班膦酸注射液5mL，稀释定容至10mL。 对照品：分别取100pL PO33-、250 puL PO4、500pL伊班膦酸储备液(1000 mg/L)， 用超纯水稀释定容至100 mL， 配制得 1 mg/L PO33-、2.5 mg/L PO4、5 mg/L 伊班膦酸对照品溶液。 图1对照品谱图 8 8 60 =3.393杂质 5.157杂质 6.853'杂质3 8.260杂质4 近年来，随着前处理方法的不断优化，新型多功能色谱柱的开发，淋洗液发生器技术的日益成熟，多种检测器联用技术的探索，离子色谱（IC）在制药行业中的应用越来越广泛。离子色谱（IC）适合检测一些能够溶于水，并有一定解离度的化合物，特别不易挥发、又无紫外吸收的药物，以补充液相和气相对离子型药物分析的不足。离子色谱（IC）可用于分析药物或药物中阴离子、阳离子、有机酸、有机胺、糖类以及抗生素等多种组分，可为药物质量和安全提供科学保障。为此，盛瀚科研人员围绕“离子色谱在制药行业中的应用”进行了一系列实验测定，希望制药行业或行业外的工作人员对离子色谱的应用有更多参考和了解。·离子色谱在原料药及其相关制剂中的应用原料药，指用于生产各类制剂的原料，是制剂中的有效成份，由化学合成、植物提取或者生物技术所制备的各种用来作为药用的粉末、结晶、浸膏等。原料只有加工成药物制剂，才能成为供临床使用的药物，因此原料药质量好坏决定制剂质量的好坏。世界各国对于其广泛应用的原料药及其相关制剂都制定了严格的国家药典标准和质量控制方法，以加强药物中有毒成分的控制，加强对药物杂质的定性定量研究，进一步完善药物与有效性相关的质量控制要求。4.中药材中二氧化硫的测定硫磺熏蒸或浸泡是中药材、饮片的传统养护方法，它能使中药材、饮片外观光鲜，即使水分严重超标也不会霉变。但这种加工方法会导致中药材原药残留大量的二氧化硫，对人体健康有一定的影响。2020版药典规定了酸碱滴定法、气相色谱法、离子色谱法用于检测中药材中二氧化硫。其中离子色谱法需使用水蒸气蒸馏法提取中药材中二氧化硫，将其转化为亚硫酸根，进一步被双氧水氧化为硫酸根后进行分析测定。l 分析柱：SH-G-1+SH-AC-4            l 流动相：2.0 mM Na2CO3+8.0 mM NaHCO3l 流速：1.3 mL/minl 柱温：35℃                  l 抑制器：SHY-A-6l 进样体积：25 μLl 前处理：称取5~10 g供试品粗粉（准确记录质量，精确至0.0001 g），置于水蒸气蒸馏装置蒸馏，吸收液过0.22 μm滤膜进样分析。图1  中药材中二氧化硫(SO42-)谱图5. 达肝素钠中亚硝酸根和硫酸根离子的测定达肝素钠为猪黏膜的低分量肝素钠，平均分子量4000～6000，为新一代抗血栓形成药，具有明显的抗血栓形成功能，尤其抗凝血第Ⅹa因子的功能很强，但抗凝作用微弱，抗凝血酶作用极微弱。达肝素钠是由普通肝素解聚或经酶作用而获得，具有普通肝素所不具备的优点。近年的研究结果表明，其疗效高于普通肝素，具有使用方便，相对安全等优点，可在院外使用。达肝素钠常存在游离的亚硝酸根和硫酸根离子，可用离子色谱法进行定性定量分析。（1）达肝素钠中亚硝酸根离子l 分析柱：SH-G-1+SH-AC-3            l 流动相：166 mM NaAc（磷酸调节pH至4.3）l 流速：1.0 mL/minl 柱温：室温                     l 检测方式：直流安培法l 施加电压：1.0 Vl 进样体积：100 μLl 前处理：准确称取固体样品80 mg，加纯净水定容至10 mL，过0.22 μm滤膜进样分析。图1  达肝素钠中亚硝酸根离子谱图（2）达肝素钠中硫酸根离子l 分析柱：SH-G-1+SH-AC-3            l 流动相：2.0 mM Na2CO3+8.0 mM NaHCO3l 流速：1.0 mL/minl 柱温：35℃                     l 抑制器：SHY-A-6l 进样体积：25 μL图2  达肝素钠中硫酸根离子谱图6. 硫酸软骨素中硫酸根离子的测定硫酸软骨素（CS），是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。在医学上主要是作为治疗关节疾病的药品，与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效，可以从根本改善关节问题。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺聚合而成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。虽然多糖的主链结构并不复杂，但硫酸化程度、硫酸基多少是决定其活性大小的极为重要的指标。因此检测硫酸软骨素中硫酸根离子的含量，对于活性研究和临床应用重要的意义。l 分析柱：SH-G-1+SH-AC-4             l 流动相：2.0 mM Na2CO3+8.0 mM NaHCO3l 流速：1.3 mL/minl 柱温：35℃                     l 抑制器：SHY-A-6l 进样体积：25 μLl 前处理：样品过0.22 μm一次性针头过滤器进样分析。图1  硫酸软骨素中硫酸根离子谱图7. 伊班膦酸钠中亚磷酸根和磷酸根离子的测定伊班膦酸钠（IB），化学名称为1-羟基-3-(N-甲基-N-戊胺基)亚丙基双膦酸单钠盐一水合物。IB属于第三代双膦酸类药物，用于治疗恶性肿瘤骨转移、预防骨转移及乳腺癌骨转移后骨骼事件的发生，并可预防和治疗骨质疏松症，是目前适应症最广的双膦酸盐药物，具有高效、低毒和使用方便等优点。随着IB临床应用的增多，有必要建立便捷、灵敏的检测方法，为药品质量检测提供技术支持。磷酸根和亚磷酸根作为伊班膦酸钠注射液中的有关物质，分析方法主要有容量分析法、分光光度法、高效液相色谱-示差折光检测法、离子色谱法等。通常情况下，容量分析和分光光度法易受制剂中辅料干扰，现已较少应用；示差折光检测法对离子态物质灵敏度低，受流动相组成的波动影响较大，不适合梯度洗脱；离子色谱法因其准确、快速、选择性好，可同时分离多组分物质等优点被广泛应用。l 分析柱：Ion Pac AG11-HC+AS11-HC             l 流动相：KOH梯度洗脱               0-5 min，16 mM KOH；               5-7 min，16-25 mM KOH；               7-17 min，25 mM KOH；               17-20 min，25-45 mM KOH；               20-23 min，45 mM KOH；               23.1-28 min，25 mM KOH；               28.1-39 min，16 mM KOH。l 流速：1.0 mL/minl 柱温：35℃                     l 抑制器：SHY-A-6l 进样体积：20 μLl 前处理：储备液：分别准确称取0.1048 g亚磷酸、0.1123 g伊班膦酸钠，加超纯水稀释定容至100 mL，配制得PO33-、伊班膦酸1000 mg/L储备液。供试品：取伊班膦酸注射液5 mL，稀释定容至10 mL。对照品：分别取100 μL PO33-、250 μL PO43-、500μL伊班膦酸储备液(1000 mg/L)，用超纯水稀释定容至100 mL，配制得1 mg/L PO33-、2.5 mg/L PO43-、5 mg/L伊班膦酸对照品溶液。图1 对照品谱图图2 供试品谱图