预混合饲料中Vitamin B12检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific 除杂/富集柱洗脱条件见表1ThermoFisherSCIENTIFICt330热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com 在线净化/富集法测定预混合饲料中Vit B12 邢占磊王畅曹建明 赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词 预混合饲料，B12，在线富集，大体积 摘要 维生素B12也称氰钴胺，是常见的一种水溶性维生素，若缺乏会导致恶性贫血，但是过量摄入，又会造成叶酸缺乏。因此需要对其进行准确定量。HPLC法测定是常用的一种方法。 1.引言 饲料由于基质复杂，前处理及其简单，因此杂质干扰严重，并且符合预混饲料中含量较低，常规的检测方法由于灵敏度的问题无法准确定量。因此本方法采用大体积进样的方式，以便有足够的VB12被检测到。由于直接的大体积进样，会引入大量的杂质进来，因此采用C18固相萃取的方式使样品净化和浓缩，本方法充分的发挥双三元液相色谱的优势，采用在线的浓缩、除杂的方式进行。 2.1仪器与试剂 2.1.1 Thermo Fisher Ultimate 3000 高效液相色谱仪，泵：DPG-3600RS Pump，自动进样器：WPS-3000SL Syringe为2500pL， 定量环为2500pL，柱温箱： TCC-3000RS，检测器：DAD3000RS，色谱软件：变色龙Chromeleon7.2 2.1.2 试剂、标品，维生素B12对照品(采购与中检所)去离子水(18.2M -cm， Thermo Scientific""genPureProM UV-TOC)；甲醇(99.9%，Fisher)；乙腈(99.9%，Fisher)；磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 2.3色谱条件 U3000LC连接图见图1。 富集柱： Acclaim 120 C18 (3.0x 50 mm， 33pm) 分析柱： Acclaim PAl C18 (4.6 x50 mm，33um) 柱温：25℃； 进样量：2500pL； 检测波长：361nm；4nm 参比波长： off分析柱及富集柱梯度如下表： 表1.除杂/富集柱洗脱条件 时间 水(%)· 乙腈 流速 0 95 5+ 0.6 9口 75 25 0.6 11+ 20 80+ 0.6 15+ 0 100 0.6 15.1+ 95+ 5+ 0.6 25+ 95+ 5 0.6 分析柱梯度洗脱条件见表2 表2.分析柱梯度洗脱条件 时间 0.1%磷酸水溶液· 乙腈 流速 0 90 10+ 0.6 10 90 10 0.6 15 65 35+ 0.6 18 5+ 95+ 0.6+ 22 5+ 95+ 0.6 22.1 90 10 0.6 系统连接示意图。如下 图1-1.阀1-2位相通时连接图 六通阀切换时间表格，见表3 表3.六通阀切换时间表 时间(min) 阀位置 0 1-2 10.5 6-1 10.8 1-2 3.样品处理 3.1储备液的制备：准确称取0.1030g(精确到0.0001g) 入适量的甲醇使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为 1.03mg/ml 的浓储备溶液。 取上述储备液200uL， 置于 50ml棕色容量瓶中，加水 稀释至刻度，即得到浓度为 4.12ug/ml 的标准溶液。 取上述储备液 1mL， 置于 100ml 棕色容量瓶中，加水 稀释至刻度，即得到浓度为41.2ng/ml 的标准溶液。 3.2样品溶液制备：称取混合均匀的样品2-3g，置于50mL离心管中，准确加入水20mL，充分摇匀30s，再置于超声水浴中超声提取30min，期间摇动两次，于离心机上8000r/min， 离心5分钟，取上清液，2.2um的绿膜过滤，进样。 4.1标准品、实际样品与空白溶剂色谱图： 图2-1空白溶剂色谱图 图2-2标准品色谱图 图2-3实际样品色谱图 4.2线性曲线 按照国标要求浓度为41.2ng/ml 的标准溶液强制过原点，绘制标准曲线。线性方程： Y=0.0387X 4.3系统适用性实验：连续六针标准溶液，重现性数据详见表4 表4峰面积保留时间与峰面积重复性 序号 化合物 重复性 RSD (%) Vit B12 0.48 4.4样品测定结果 取样品2批，制备供试品溶液并测定，结果见表5。 表5样品测定结果 编号 VitB12含量 (mg/Kg) 0.7415 2 未检出 5.讨论 5.1本方法结果可以看出此方法分离度，灵敏度良好， 5.2本方法采用在线富集除杂的方法，无需繁琐的前处理过程，样品超声完过滤后即可直接上样，且分析时间短，国标方法中采用离子对试剂，色谱柱平衡时间较长，并且峰形极差，如下图3所示。本方法中流动相配制简单水相中加点磷酸即可。 图3 国标方法运行 VitB12标准品色谱图 5.3方法分离度较高，定量更加准确。实验中尝试 SPE 柱使用 PAIIC18 柱，标准品与样品色谱图如4图所示，样品基质干扰较严重，无法准确定量。 图4 SPE 使用 PAII C18 柱运行的标品与样品色谱图 饲料由于基质复杂，前处理及其简单，因此杂质干扰严 重，并且符合预混饲料中含量较低，常规的检测方法由 于灵敏度的问题无法准确定量。因此本方法采用大体 积进样的方式，以便有足够的 vb12被检测到。由于直 接的大体积进样，会引入大量的杂质进来，因此采用c18 固相萃取的方式使样品净化和浓缩，本方法充分的 发挥双三元液相色谱的优势，采用在线的浓缩、除杂的 方式进行。