采用在线中心切割二维液相色谱法快速分析特医食品中维生素A、维生素D和维生素E四种异构体的含量

thermoscientific 实验结果和讨论 热线800 8105118电话4006505118www.thermofisher.com仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 采用在线中心切割二维液相色谱法快速分析特医食品中维生素A、维生素D和维生素E四种异构体的含量 熊亮冉良骥金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词 特医食品，维生素A，维生素D，α-生育酚，β-生育酚，y-生育酚，6-生育酚，二维液相色谱，中心切割 维生素是人体生长发育所必需的营养元素，其中维生素A、维生素D和维生素E是机体维持正常代谢和机能的所必需的脂溶性维生素。除了维生素A、维生素D2和D3，以及α-维生素E(α-生育酚)外，相关研究发现维生素E的其它生育酚异构体对人体也有一定生理作用，其中以β、y、i8-生育酚形式较为常见?。 特医食品(即特殊医学用途配方食品)，是为了满足进食受限、消化吸收屏障、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食需求，专门加工配制而成的配方食品。该类产品必须在医生或临床营养师指导下，单独食用或与其他食品配合食用B。根据食品安全国家标准特殊医学用途配方食品通则GB29922-2013的规定，特医食品中维生素A、D、E的分析遵循食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定规定4。食品中维生素D由于本身含量低、基质干扰严重，国家标准方法采用液质联用或半制备正相净化、反相分析的方式对其进行分离检测。但液质联用方法复杂，维护成本相对较高；而正相净化方法易受流动相等条件影响，极大影响样品的分析效率和方法重复性。 本文在前期已经建立的同时测定食品中维生素A、D和4种维生素E异构体含量在线二维液相色谱法基础上[5-6]，进一步优化色谱分析条件，建立了特医食品中VA、四种VE异构体及微量VD的中心切割快速分析方法，缩短了样品分宁时间，进一步提高了方法分析效率，可以用于特医食品等多种食品基质中维生素A、D和E的常规快速检测。 1、仪器与试剂 1.1仪器 Thermofisher UltiMate3000 双三元液相色谱系统：双三元梯度泵(包含两个独立的三元梯度泵)；自动进样器；带两个2位6通阀的柱温箱；二极管阵列检测器(配13uL流通池)；500uL样品收集环； Chromeleon 7.2.10变色龙色谱数据软件。 1.2试剂 甲醇(色谱级， Fisher公司)，乙腈(色谱级， Fisher公司)，去离子水(18.2MQ， Millipore纯水机)； 1.3标准品 维生素A(all-trans retinol， ≥95%， Sigma-Aldrich)， 维生素D2(98.1%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)， 维生素D3(99.6%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，α-生育酚(98.0%， Sigma-Aldrich)β、丫、8-生育酚(≥96%， Sigma-Aldrich)。 2、标准品溶液制备 分别精密称量维生素A、D2、D3，，(α、β、y和8-生育酚标准品适量，至10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度分别为0.5mg/mL的维生素A溶液， 0.25mg/mL的维生素D2和D3溶液， 2.0mg/mL的α、β、y-8- 生育酚溶液。分别精密量取维生素A、D2、D3，α、β、和8-生育酚标准品溶液适量，至10mL棕色容量瓶中，甲醇稀释定容成系列标准混合溶液，各标准品溶液浓度见表1。 表1各维生素混合标准品工作溶液浓度 Vitamins Retention Concentration Level ug/mL Time， min 1 2 3 4 5 6 7 VA 3.770 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 10.0 α-VE 7.177 2.0 5.0 10.020.040.060.01100.0 B-VE 7.627 2.0 5.0 10.020.040.060.0100.0 y-VE 7.790 2.0 5.0 10.020.040.060.0100.0 8 -VE 8.140 2.0 5.0 10.020.040.060.0100.0 VD2 12.760 0.020.05 0.1 0.2 0.4 0.6 1.0 VD3 13.007 0.020.05 0.1 0.2 0.4 0.6 1.0 3、样品溶液制备 参考GB 5009.82-2016的方法，精密称取固体特医食品样品约5g(精确到0.01g)于150mL平底烧瓶中，固体试样需用约20mL45℃~50℃温水使其溶解，混匀。 于上述处理的试样溶液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT， 混匀，加入30mL无水乙醇，充分混匀后加入约20mL 0.5g/g的氢氧化钾水溶液混匀，在80℃恒温水浴条件下，磁力搅拌皂化约30min后，取出立刻用冷水冷去到室温。 3.2液液萃取 将上述皂化液转移入250mL分液漏斗中，加入50mL石油醚-乙醚混合液(1：1，V：V)，振荡萃取5min，将下层溶液转移至另一个250mL分液漏斗，加入50mL石油醚-乙醚混合液再次萃取，合并醚液，用约100mL水洗涤醚液，重复3次，至醚液洗至中性。醚液通过无水硫酸钠脱水过滤，滤液收入250mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上在40℃左右水浴旋蒸至约2mL， 立即氮气吹干，准确加入1mL甲醇复溶后，上机分析。 4、色谱条件 色谱条件见表2，一维和二维梯度程序以及阀切换时间见表3，仪器连接图见图1。 表2色谱条件 维色谱柱 二维色谱柱 Accucore PFP 4.6x100 mm， 2.6 um； P/N： 17426-104630FOODKIT1& 2 ADE 4.6×100 mm， 2.6 um； P/N： VITADE-004K1 柱温 25℃ 进样量 表3一维和二维梯度程序及阀切换时间 = -维分析泵时间(分钟) A% B% C%0 20 80 0 二维分析泵时间(分钟) A% B% C% 阀切换时间时间(分钟) 左阀 右阀 0 0 40 60 0 6_1 12 9 0 100 0 1 0 40 60 5.9 61 61 10 0 100 0 2 60 0 40 6.2 61 12 11 20 80 0 6.5 60 0 40 9 1_2 61 15 20 80 0 7 0 40 60 40 60 图1仪器连接图 1、色谱条件优化 本文在前期已经建立的同时测定食品中维生素A、D和4种维生素E异构体含量在线二维液相色谱法基础上，进一步优化色谱分析条件，建立了特医食品中VA、四种VE异构体及微量VD的中心切割快速分析方法。整个分析方法从原来的24min缩短至15min，大大缩短了样品分析时间，进一步提高了方法分析效率。混合标准品溶液分析谱图及典型特医食品样品分析谱图分别见图2和图3。从图中可见，在缩短了分析时间的同时，依然可以保证一维色谱柱对维生素A、四种维生素E异构体以及杂质的良好分离，二维色谱柱对两种维生素D异构体和杂质的良好分离。 500. B 图2维生素A、D和E混合标准溶液分析谱图 (A，其中0~9min 为一维谱图，9~15min 为二维谱图；B，二维放大图谱) 5三 150 1500 图3典型特医食品样品分析谱图 (A，其中0~9min为一维谱图，9~15min 为二维谱图；B，二维放大图谱) 2、方法线性、灵敏度及精密度结果 本文按照食品国标要求，考察了维生素A、维生素D2和D3以及维生素E的4个异构体的线性及检测限。结果如表4所示，不同维生素在不同的线性范围内均保持良好线性关系，相关系数R?大于0.9996。方法灵敏度较高，维生素D3的检测限可达3.0 ng/mL。 取0.1pg/mL混合标准品溶液，连续进样6次，结果维生素A、维生素D2和D3以及维生素E的4个异构体的保留时间RSD均小于0.5%，峰面积RSD均小于1%，表明方法精密度较好。 表4方法线性及检测限结果 Vitamins Detection wavelength， nm Range， ug/mL Linearity equation R2 LOD， ng/mL A 325 0.2-10 Y=1.3997X+0.0013 0.9999 5.3 D2 264 0.02-1 Y=0.6316X+0.0004 0.9998 3.4 D3 264 0.02-1 Y=0.7011X+0.0004 0.9999 3.0 α-VE 294 2-100 Y=0.0530X-0.0339 0.9999 74 B-VE 294 2-100 Y=0.0620X-0.0069 0.9996 Y-VE 294 2-100 Y=0.0746X-0.0072 0.9998 8 -VE 294 2-100 Y=0.0663X-0.0023 0.9998 本文基于二维液相色谱技术，利用赛默飞双三元液相色谱系统，在前期已经建立的同时测定食品中维生素A、D和4种维生素E异构体含量在线二维液相色谱法基础上，进一步优化了色谱分析条件，实现了特医食品中VA、四种VE异构体及微量VD的快速分析。本方法简便快速，自动化程度高，可以用于特医食品等多种食品基质中维生素A、D和E的常规快速检测。 ( 参考文献 ) ( Stillwell W， An introduction to biological membranes (secondedition) M. Amsterdam： Elsevier Science， 2 016. ) ( 2Kamal-Eldin A.， Gorgen S， Lampi A， Normal ph a se high per-formance liquid c hromatography of tecopherols and tocotri-enols. Comparison of different chromatographic columns . Journal of Chromatography A， 2000， 881：217-227. ) ( ③GB 29922-2013，食品安全国家标准特殊医学用途配方食品通则 ) ( [4] GB 5009.82-2016，食品安全国家标准食品维维生素 A、D、E的测定 ) ( Zhang Y H， Z hang D W ， Cao Y， Simultaneous determinationof vitamins A， D in vitamin A and D p harmaceutical by o n -line two - dimensional reversephase liquid chromatographyl . 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