奶及奶制品中黄曲霉素M1检测方案(核酸提取仪)

一、背景介绍 黄曲奇毒素M1。(Aflatoxin M1) 属于黄曲吉毒素一类结构相似的化合物中的一种，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲奇毒素的机率最高。物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒法破坏。哺乳类动物摄入被黄曲奇毒素B1污染的饲料或食品后，通过羟基化作用转化成黄曲奇毒可导铭肝癌基至死广1素M1。黄曲毒素M1危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。 目前来讲， Aflatoxin M1的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)， 酶联免疫检测法等。液相色谱法可以精确的检测奶制品中黄曲奇毒素的微小含量。而使用黄曲奇毒素M1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲奇毒素M1残留。 Pribolab(普瑞邦)作为专业从事奇菌毒素检测技术与产品服务的主要供应商之一，整合了原北京泰乐祺检测应用实验室，更加专注于毒菌毒素检测产品和技术解决方案的服务，以期快速提出解决方案。针对几年来牛奶及其制品中不断出现的黄曲奇毒素M1超标问题，建立了一套完整的解决方案。 二、参考标准：根据国标 《GB 5413.37-2010》食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲奇毒素M1的测定。 (一)免疫亲和柱-高效液相色谱法：符合GB 5413.37-2010国标方法 1.所需设备和耗材 高效液相色谱仪 色谱柱：真菌毒素专用色谱柱 (PRC-18， Pribolab). 身免疫亲和柱： PriboFastR黄曲毒素M1免疫亲和柱(IAC-012-3， Pribolab， 25支/盒，快速过柱型，适用于粘稠样本：如生鲜乳、酸奶等，有效解决过柱易堵问题)高速均质器：不锈钢耐腐蚀，转速达到22000rpm 以上(EQ-WR-1L， Pribolab). 班玻璃纤维滤纸： PriboFastR玻璃纤维滤纸 (GMF/A-110， Pribolab)PPriboFastR八位泵流操作架 (Pribolab，用于控制免疫亲和柱过柱流速)标准品： Aflatoxin M1 (固体标准品MSS1007 100ug或0.5pg/ml Aflatoxin M1 液体标准品， Pribolab)22.样品前处理：普瑞邦针对生鲜乳、干酪、奶油等提供不同的处理方案(详细方案请联系Pribolab中国：400-688-5349，普瑞邦开发了针对多种奶品基质提供优化的前处理方案) 3.免疫亲和柱净化： PriboFast@黄曲奇毒素M1免疫亲和柱(IAC-012-3， Pribolab) 富集：提取液以2-3mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体； 洗涤：10mL 0.1%的吐温/PBS清洗，以10mL水洗柱子2次， 并使2-3mL空气通过柱体。 洗脱：加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，孵育30秒以上，以流速为1-2mL/min过柱，收集全部洗脱液供检测用。 黄曲霉毒素M1 4.高效液相色谱分析 色谱柱： C18，长25 cm， 内径4.6 mm； 流动相：25%乙腈水溶液(10.2.1)； 汤流速：1mL/min。 (二)酶联免疫法 1.方法原理 采用直接竞争酶联免疫法，在微孔板上预包被黄曲奇毒素M1抗原，加入样本(或黄曲奇毒素M1标准品溶液)及辣根过氧化物酶标记的黄曲毒毒素M1抗体。样本或标准品溶液中的抗原与预包被在板孔上的抗原竞争结合酶标抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样品吸光值与其所含黄曲毒毒素M1量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲油毒素M1的含量。2 2.试剂和材料：酶联免疫试剂盒 (PriboFastR黄曲奇毒素M1试剂盒EKT-012， Pribolab) 3.样本前处理：牛奶：高心取下层待测。奶粉：复溶溶心取下层待测。 4.检测步骤 4.1免疫反应30min；洗板5次；显色反应30min；终止反应，酶标仪读OD值。 5.分析结果的表述 用酶标仪判读结果。 (三)免疫金标快速检测法 1.方法原理 黄曲奇毒素M1(AFM1)快速检测条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样本中的黄曲毒毒素M1在酶标孔中与胶体金标记的特异性抗黄曲奇毒素M1单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上AFM1-BSA偶联物的结合。如果样本中黄曲毒素M1含量大于0.5 ug/L，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性。22.试剂和材料肚胶体金检测试纸： PriboStripTM黄曲奇毒素M1免疫金标快速检测条 (PR-012， Pribolab) 3.分析步骤：奶粉复溶后检测；液志奶直接检测。吸取奶液滴加到加样孔中，8-15分钟读取结果。在C线显色的情况下：T线显色比C线深或一样深是阴性。T线显色比C线浅，或无显色是阳性结果。 二、参考标准：根据国标《GB 5413.37—2010》食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1 的测定。（一）免疫亲和柱-高效液相色谱法：符合GB 5413.37-2010国标方法1. 所需设备和耗材　　高效液相色谱仪色谱柱：真菌毒素专用色谱柱（PRC-18，Pribolab）。免疫亲和柱：PriboFast®黄曲霉毒素M1免疫亲和柱(IAC-012-3, Pribolab，25支/盒，快速过柱型，适用于粘稠样本：如生鲜乳、酸奶等,有效解决过柱易堵问题)。高速均质器：不锈钢耐腐蚀,转速达到22000rpm 以上(EQ-WR-1L，Pribolab)。玻璃纤维滤纸：PriboFast®玻璃纤维滤纸（GMF/A-110，Pribolab）PriboFast®八位泵流操作架（Pribolab，用于控制免疫亲和柱过柱流速）标准品：Aflatoxin M1（固体标准品MSS1007  100ug或0.5µg/ml Aflatoxin M1 液体标准品，Pribolab)2. 样品前处理:普瑞邦针对生鲜乳、干酪、奶油等提供不同的处理方案(详细方案请联系Pribolab中国:400-688-5349，普瑞邦开发了针对多种奶品基质提供优化的前处理方案)3. 免疫亲和柱净化: PriboFast®黄曲霉毒素M1免疫亲和柱(IAC-012-3, Pribolab)富集:提取液以2-3mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体；洗涤: 10mL 0.1%的吐温/PBS清洗，以10mL水洗柱子2次，并使2-3mL空气通过柱体。洗脱：加入1.0mL色谱级甲醇洗脱,孵育30秒以上,以流速为1-2mL/min过柱，收集全部洗脱液供检测用。4. 高效液相色谱分析 色谱柱：C18，长25 cm，内径4.6 mm；流动相：25 %乙腈水溶液(10.2.1)；流速：1 mL/min。（二）酶联免疫法1. 方法原理采用直接竞争酶联免疫法，在微孔板上预包被黄曲霉毒素M1抗原，加入样本（或黄曲霉毒素M1标准品溶液）及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。样本或标准品溶液中的抗原与预包被在板孔上的抗原竞争结合酶标抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样品吸光值与其所含黄曲霉毒素M1量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲霉毒素M1的含量。2. 试剂和材料：酶联免疫试剂盒（PriboFastR黄曲霉毒素M1 试剂盒 EKT-012，Pribolab）3. 样本前处理：牛奶：离心取下层待测。奶粉：复溶离心取下层待测。4. 检测步骤4.1 免疫反应30min；洗板5次；显色反应30min；终止反应，酶标仪读OD值。5. 分析结果的表述用酶标仪判读结果。（三）免疫金标快速检测法1. 方法原理黄曲霉毒素M1(AFM1)快速检测条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样本中的黄曲霉毒素M1在酶标孔中与胶体金标记的特异性抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上AFM1－BSA偶联物的结合。如果样本中黄曲霉素M1含量大于0.5 ug/L，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性。2. 试剂和材料胶体金检测试纸：PriboStripTM黄曲霉毒素M1免疫金标快速检测条（PR-012，Pribolab）3. 分析步骤：奶粉复溶后检测；液态奶直接检测。吸取奶液滴加到加样孔中，8-15分钟读取结果。在C线显色的情况下：T 线显色比C线深或一样深是阴性。T 线显色比C线浅，或无显色是阳性结果。孙庆磊 17615852702