食品中蛋白质检测方案(培养箱)

一、适用范围： 适用于各种食品中蛋白质的测定。 一、实验原理： 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 三、仪器和设备： 3.1天平：感量为1mg。 3.2万用电炉。 3.3定氨蒸馏装置：如图1所示， 3.4自动凯氏定氨仪。 四、试剂和材料 除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的三级水。 4.1硫酸铜 (CuSO45H2O)。 4.2硫酸钾(K2SO4)。 4.3硫酸(H2SO4 密度为1.84g/L)。 4.4硼酸(H3BO3)。 4.5甲基红指示剂(C15H15N3O2)。 4.6 溴甲酚绿指示剂( C21H14Br4O5S)。 4.7亚甲基蓝指示剂(C16H18CIN3S3H2O)。 4.8氢氧化钠 (NaOH)。 4.9 95%乙醇(C2H5OH). 4.10硼酸溶液(20g/L)：称取 20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000 mL. 4.11氢氧化钠溶液(400g/L)：称取 40g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至 100 mL. 4.12硫酸标准滴定溶液(0.0500m0o0ln/ L) 或 盐 酸标 准杉 定 溶液 (0 .90590.0 5m0o0l9/5L)%。2 4.13甲基红乙醇溶液(1g/L)：称取0.1g甲基红， 溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL. 4.14 亚甲基蓝乙醇溶液(1g/L)：称取 0.1g亚甲基蓝， 溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL. 4.15溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L)：称取0.1g 溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用 95%乙醇稀释至 100 mL. 4.16混合指示液：2份甲基红乙醇溶液(4.13)与1份亚甲基蓝乙醇溶液(4.14)临用时混合。也可用1份甲基红乙醇溶液(4.13)与5份溴甲酚绿乙醇溶液(4.15)临用时混合。 五、分析步骤 5.1凯氏定氮法 5.1.1试样处理：称取充分混匀的固体试样0.2 g~2 g、半固体试样2g~5 g 或液体试样10 g~25 g (约相当于30 mg~40 mg氨)，精确至0.001 g， 移入干燥的100 mL、250 mL 或 500 mL 定氮瓶中，加入0.2g 硫酸铜(4.1)、6g硫酸钾(4.2)及20 ml 硫酸(4.3)，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45°斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热 0.5 h~1h。取下放冷，小心加入20 mL水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水水刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。5.1.2测定：按图1装好定氨蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至 2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液(4.13)数滴及数毫升硫酸(4.3)，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。 5.1.3向接收瓶内加入 10.0 mL 硼酸溶液(4.10)及1滴~2滴混合指示液(4.16)，并使冷凝管的下端插入液面下，气根据试样中氮含量，准确吸取 2.0 mL~10.0mL 试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将 10.0 mL 氢氧化钠溶液(4.11)倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏 10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面液开冷凝管下端，再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液(4.12)滴定至终点，其中2份甲基红乙醇溶液(4.13)与1份亚甲基蓝乙醇溶液(4.14)指示剂，颜色由紫红色变成灰色， pH5.4；；1份甲基红乙醇溶液(4.13)与5份溴甲酚绿乙醇溶液(4.15)指示剂，颜色由酒红色变成绿色， pH 5.1。同时作试剂空 白。 1一电炉；2一水气发生器(2L烧)； 3一螺旋夹：4一小玻杯及棒状玻塞：5一反应室：6一反应室外层：7一橡皮管及联夹；8一冷凝管：9一蒸增液收 5.2自动凯氏定氨仪法 称取固体试样0.2 g~2 g、半固体试样2g~5g 或液体试样 10g~25g (约相当于 30 mg~40 mg氨)， 精确至0.001 g。按照仪器说明书的要求进行检测。六、分析结果的表述 试样中蛋白质的含量按式(1)进行计算。 式中： -试样中蛋白质的含量，单位为克每百克(g/100 g) ； w-试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(mL)；ww -试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为为升(mL)； -吸取消化液的体积，单位为毫升(mL)； c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为位尔每升(mol/L)； 0.0140——1.0mL 硫酸[c (1/2H2SO4)=1.000 mol/L]或盐酸[c(HCl) =1.000 mol/L]标准滴定溶液 相当的氮的质量，单位为克(g)； m一一试样的质量，单位为克(g)； F仁-氨换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制司品纯为 6.38； 面粉为 5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为 5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵为 5.30；复合配方食品为6.25。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量21 g/100 g 时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量<1 g/100 g时，结果保留两位有效数字。 七、精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 三、仪器和设备：3.1 天平：感量为 1mg。3.2 万用电炉。3.3 定氮蒸馏装置：如图 1 所示。3.4 自动凯氏定氮仪。四、试剂和材料除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的三级水。4.1 硫酸铜（ CuSO4·5H2O）。4.2 硫酸钾（ K2SO4）。4.3 硫酸（ H2SO4 密度为 1.84g/L）。4.4 硼酸（ H3BO3）。4.5 甲基红指示剂（ C15H15N3O2）。4.6 溴甲酚绿指示剂（ C21H14Br4O5S）。4.7 亚甲基蓝指示剂（ C16H18ClN3S·3H2O）。4.8 氢氧化钠（ NaOH）。4.9 95%乙醇（ C2H5OH）。4.10 硼酸溶液（ 20 g/L）：称取 20 g 硼酸，加水溶解后并稀释至 1000 mL。4.11 氢氧化钠溶液（ 400 g/L）：称取 40 g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至 100 mL。4.12 硫酸标准滴定溶液（ 0.0500 mol/L）或盐酸标准滴定溶液（ 0.0500 mol/L）。4.13 甲基红乙醇溶液（ 1 g/L）：称取 0.1g 甲基红，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀释至 100 mL。4.14 亚甲基蓝乙醇溶液（ 1 g/L）：称取 0.1g 亚甲基蓝，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀释至 100 mL。4.15 溴甲酚绿乙醇溶液（ 1 g/L）：称取 0.1g 溴甲酚绿，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀释至 100 mL。4.16 混合指示液： 2 份甲基红乙醇溶液（ 4.13）与 1 份亚甲基蓝乙醇溶液（ 4.14）临用时混合。也可用1 份甲基红乙醇溶液（ 4.13）与 5 份溴甲酚绿乙醇溶液（ 4.15）临用时混合。五、 分析步骤5.1 凯氏定氮法5.1.1 试样处理：称取充分混匀的固体试样 0.2 g～2 g、半固体试样 2 g～5 g 或液体试样 10 g～25 g（约相当于 30 mg～40 mg 氮），精确至 0.001 g，移入干燥的 100 mL、 250 mL 或 500 mL 定氮瓶中，加入 0.2 g 硫酸铜（ 4.1）、 6 g 硫酸钾（ 4.2）及 20 mL 硫酸（ 4.3），轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45°斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热 0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入 20 mL 水。放冷后，移入 100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。5.1.2 测定：按图 1 装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至 2/3 处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（ 4.13）数滴及数毫升硫酸（ 4.3），以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。5.1.3 向接收瓶内加入 10.0 mL 硼酸溶液(4.10)及 1 滴～2 滴混合指示液（ 4.16），并使冷凝管的下端插入液面下， 根据试样中氮含量， 准确吸取 2.0 mL～10.0 mL 试样处理液由小玻杯注入反应室， 以 10 mL洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将 10.0 mL 氢氧化钠溶液(4.11)倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏 10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏 1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。以硫酸或盐酸标准滴定溶液(4.12)滴定至终点，其中 2 份甲基红乙醇溶液(4.13)与 1 份亚甲基蓝乙醇溶液(4.14)指示剂，颜色由紫红色变成灰色， pH 5.4； 1 份甲基红乙醇溶液(4.13)与  5 份溴甲酚绿乙醇溶液(4.15)指示剂，颜色由酒红色变成绿色， pH 5.1。同时作试剂空白。5.2 自动凯氏定氮仪法称取固体试样 0.2 g～2 g、半固体试样 2 g～5 g 或液体试样 10 g～25 g （约相当于 30 mg～40 mg 氮），精确至 0.001 g。按照仪器说明书的要求进行检测。六、 分析结果的表述试样中蛋白质的含量按式（ 1）进行计算。式中：X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（ g/100 g）；V1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（ mL）；V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（ mL）；V3——吸取消化液的体积，单位为毫升（ mL）；c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升（ mol/L）；0.0140——1.0 mL 硫酸[c (1/2H2SO4)＝1.000 mol/L]或盐酸[c (HCl) ＝1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克（ g）；m——试样的质量，单位为克（ g）；F——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为 6.25；纯乳与纯乳制品为 6.38；面粉为 5.70；玉米、高粱为 6.24；花生为 5.46；大米为 5.95；大豆及其粗加工制品为 5.71；大豆蛋白制品为 6.25；肉与肉制品为 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵为 5.30；复合配方食品为 6.25。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1 g/100 g 时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g 时，结果保留两位有效数字。七、 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。联系人：孙庆磊 17615852702