裂解物中靶标蛋白检测方案(凝胶成像系统)

你想知道的荧光定量Western上样量解答来啦 荧光定量Western Blot，绝对不是上样量越多越好。可靠的Western Blot印迹数据通过加载适当量的样品才能获得。加载过多的蛋白会导致信号饱和或用于检测的荧光基团的自猝灭。 那么，您如何知道要加载多少裂解液呢？首先使用BCA或Bradford等蛋白测定方法测量裂解液样品的浓度。一旦知道样品的浓度，便可以确保每种样品的加载量相同。 于此同时，您仍然需要一种方法来校准凝胶加载量和转印效率的问题。蛋白印迹定量的最佳方法和新共识是将蛋白进行归一化。许多期刊都接受了总蛋白质归一化（TPN），有些期刊（例如《JBC》）甚至要求作者在Western印迹的定量数据时使用TPN或使用验证过的看家蛋白进行归一化。 在下面的实验中，加载了0.2-50µg的HeLa裂解物，以检测靶标蛋白STAT3与内参对照GAPDH和总蛋白膜染色的性能。尽管Total-PVDF膜染色线性最高至50μg裂解物，但这显然不是靶标蛋白STAT3加载的理想上样量，因为信号在12.5μg以上不再线性。上样控制GAPDH的归一化提出了一个严重的问题，因为它在裂解物的浓度低于1µg时呈线性，因此其定量用途非常有限。 一般而言，我们建议不要加入超过20µg的裂解物，因为这通常会导致蛋白定量方面的问题。为了获得最佳的荧光定量Western印迹，不要忘记应用适当的归一化策略并加载适量的蛋白。 Azure Imager多功能分子成像系统 ☑   双激光近红外成像：激发强度大、信噪比高、光泄漏少。 ☑   RGB可见荧光多功能检测：可进行小鼠成像、转基因植物筛选、模式生物斑马鱼成像、培养皿成像等。 ☑   同时4通道荧光成像，检测更高效。 ☑   高灵敏化学发光和彩色Marker成像。 ☑   彩色蛋白胶和核酸胶成像。 参考文献： 1. Collecting and presenting data. The Journal of Biological Chemistry. website.:http://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data#blot. Accessed February 4, 2019. 2. Fosang AJ and Colbran RJ. Transparency Is the Key to Quality. J Biol Chem. Dec. 11 2015. 290(50). 29692–29694. PMCID: PMC4705984. 荧光定量Western Blot，绝对不是上样量越多越好。可靠的Western Blot印迹数据通过加载适当量的样品才能获得。加载过多的蛋白会导致信号饱和或用于检测的荧光基团的自猝灭。那么，您如何知道要加载多少裂解液呢？首先使用BCA或Bradford等蛋白测定方法测量裂解液样品的浓度。一旦知道样品的浓度，便可以确保每种样品的加载量相同。于此同时，您仍然需要一种方法来校准凝胶加载量和转印效率的问题。蛋白印迹定量的最佳方法和新共识是将蛋白进行归一化。许多期刊都接受了总蛋白质归一化（TPN），有些期刊（例如《JBC》）甚至要求作者在Western印迹的定量数据时使用TPN或使用验证过的看家蛋白进行归一化。在下面的实验中，加载了0.2-50µg的HeLa裂解物，以检测靶标蛋白STAT3与内参对照GAPDH和总蛋白膜染色的性能。尽管Total-PVDF膜染色线性最高至50μg裂解物，但这显然不是靶标蛋白STAT3加载的理想上样量，因为信号在12.5μg以上不再线性。上样控制GAPDH的归一化提出了一个严重的问题，因为它在裂解物的浓度低于1µg时呈线性，因此其定量用途非常有限。一般而言，我们建议不要加入超过20µg的裂解物，因为这通常会导致蛋白定量方面的问题。为了获得最佳的荧光定量Western印迹，不要忘记应用适当的归一化策略并加载适量的蛋白。Azure Imager多功能分子成像系统☑   双激光近红外成像：激发强度大、信噪比高、光泄漏少。☑   RGB可见荧光多功能检测：可进行小鼠成像、转基因植物筛选、模式生物斑马鱼成像、培养皿成像等。☑   同时4通道荧光成像，检测更高效。☑   高灵敏化学发光和彩色Marker成像。☑   彩色蛋白胶和核酸胶成像。参考文献：1. Collecting and presenting data. The Journal of Biological Chemistry.website.:http://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data#blot. Accessed February 4, 2019.2. Fosang AJ and Colbran RJ. Transparency Is the Key to Quality. J Biol Chem. Dec. 11 2015. 290(50). 29692–29694. PMCID: PMC4705984.