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Application No.65News 利用质谱分析仪 MALDI-TOF MS分析动物的毛发 大箬信一*1、岛圭介*2 关键词:动物毛发,山羊绒,羊毛,混合率,异物分析 1)大阪大学研究生院工学研究科2)S&B食品株式会社 摘要 2018年,通过使用质谱分析仪 MALDI-TOFMS 检测动物种类特异性的兽毛肽的辨别动物毛发的方法成为 ISO 标准得以发表。该辨别方法也适用于一根毛发的分析,因此不仅可以防止伪造山羊绒,也可应用于羽毛和人体毛发等各种动物毛发的辨别以及食品混入异物的检查。 本文文除以往标准型号的 MALDI-TOF MS AXIMAPerformance 之外,还将向您介绍使用价格更加低廉、结构紧凑的台式 MALDI-TOF MS MALDI-8020,根据ISO标准进行动物毛发纤维定性/定量的分析案例。 ( *2株式会社岛津制作所全球应用开发中心 ) 1.前言 正确分析动物毛发(动物的毛)的技术在各种领域中扮演着重要角色。兽毛应用于大衣、上衣、毛衣等各种纤维产品中。根据家庭用品质量显示法的规定,这些纤维产品必须标明纤维的种类,使用多种纤维时必须表示其混用率。此外,在食品中混入毛发时,确定其种类是明确混入路径的重要手段。 以往,几乎所有确定动物毛发种类的方法都是使用显微镜。毛皮的话,可以根据外观相对容易地推测出动物种类,但纤维产品的话,经过了脱色、染色等处理,难以通过外观推测出动物皮毛的种类。使用显微镜,以400倍左右的倍率进行观察,可以在毛发表面看到被称为角质层的鳞状结构,此外还可以在毛发中央部分观察到被称为毛髓质的、内含空气的结构。通过详细观察毛发的粗细、颜色以及毛发的形状,可以判别动物毛发的种类。 但是,10多年前,有人使用难以与山羊绒区分开来的牦牛假冒山羊绒,更加客观的分析动物毛发的方法得以开发。 人与动物毛发的结构十分相似。除去水分后,毛发的90%左右由蛋白质构成。图1所示为动物毛发的结构。以角蛋白1和角蛋白Ⅱ等分子量在5万左右的蛋白质成对的结构为基础,,这些蛋白质大量聚集在一起形成纤维状结构。除此之外,在其周围包裹被称为角蛋白结合蛋白质的低分子量蛋白质,形成角质层等。角蛋白蛋白质含有大量氨酸,硫磺原子,由两个原子结合在一起,形成牢固的网状结构。 图1动物毛发的模式图 图2利用MALDI-TOF MS分析动物毛发的方法 1.使用剪刀和球磨机等粉碎动物毛发纤维,2.还原、溶解纤维, 3.电泳已溶解的蛋白质溶液,4.对切取的点进行胰蛋白酶消化、质谱分析 2-1.蛋白质的提取和 SDS-PAGE” 取100~200 mg的毛发、线、布等试样放入50 mL烧杯中,用前端尖锐的剪刀剪4~5分钟左右。量取约10~20mg剪后试样放入2 mL的反应管中。 然后,向放有试样的反应管中加入0.5mL含 4%SDS的磷酸缓冲液 (0.1M、pH 7.8), 再加入10pL二硫苏糖醇(DTT)水溶液 (50mM),使用旋涡混合器充分搅拌。 将反应管放入铝电解槽,在95℃下反应 15分钟。 从电解槽中取出反应管,使用离心机在室温、6500G下离心1分钟。追加10 uL DTT 水溶液,再次在95℃下反应 15分钟。 结束后,从电解槽中取出反应管,使用离心机在50G 下离心1分钟,加入50 uL碘乙酰胺(IAA)溶液,在25℃下反应15分钟。离心后,加入20 uL DTT 水溶液, 停止IAA 反应。使用离心机在室温、15000G下离心5分钟。使用移液管将上清液移至其他管内,供之后的分析使用。为防止 SDS 沉淀,在室温下保存试样,不要放入冷库。 使用微板电泳装置、微凝胶对蛋白质提取液进行部分纯化。直接使用蛋白质提取液原液,或使用试样稀释液稀释至2~3倍,添加 5 pL~10 pL 作为 SDS-PAGE 的试样。 电泳10~20分钟后,从电泳装置中取出凝胶,水洗后,使用CBB染色液进行染色。确认到蛋白质带后,去除染色液,用水脱色。 通常可在上端、中央、下段确认到蛋白质带。将中央的带切成直径1mm 左右的圆或同等大小的四方形。将切好的凝胶放入96孔微板,加入100 uL 50 mM碳酸氢铵/50%乙腈,放置10分钟。去除清洗液后,再次重复2次相同的操作。此时的放置时间也可为1分钟左右。进行3次清洗之后,加入100 uL乙腈,吸去。放置10分钟左后,使凝胶干燥。 2-2.胰蛋白酶处理 在干燥的凝胶上加入35 ul胰蛋白酶溶液(1 ug/mL 50 mM碳酸氢铵水溶液),盖上封板条防止干燥,在60℃下反应30分钟,或在37℃下反应一整夜。 使用安装有C18填充硅胶移液管前端的10uL移液管吸出、排出胰蛋白酶处理液。重复10次左右后,用0.1% TFA 溶液清洗3次。最后吸入1.5~2 uL基质溶液 (5 mg/mL 0.1 %TFA、70%乙腈),在 MALDI-TOF MS 用的金属板上吸出、排出5次后,最终排出。 2-3.胰蛋白酶处理肽的 MALDI-TOF MS 分析 使用 MALDI-TOFMS 测定金属板上点出的样品。搭载于中端以上机型的高精度测定模式中的反射子模式和搭载于低端以上机型的高灵敏度测定模式中的线性模式均可进行测定。对激光功率等的测量条件进行调整,以便在观察到动物种类特异性峰值的m/z 2450-2750 的区域获得良好的分辨率。 针对同一样品重复照射50次激光,取其平均值作为1次的测定值。至少重复3次该测定。观察所得质谱 m/z 2450-2750范围的峰谱,确定所含动物种类。 3.利用 MALDI-TOF MS 确定动物毛发的方法 图3所示为使用 SDS-PAGE分析动物纤维提取液的结果。在分子量4~6万的范围内观测到2根带,并且在分子量更低的范围内观测到多根带。图4(a)~(e)所示为山羊绒,从各带采集点,针对各点进行胰蛋白酶处理后进行质谱分析。 针对各质谱数据与数据库进行比对,结果表明条带1为角蛋白 Type ll,条带2为角蛋白 Typel的蛋白质。其他带推测为角蛋白结合蛋白质的产物,但并无法鉴定。 图3动物毛发蛋白质提取液的 SDS-PAGE 横纹的部分表示存在各自不同的蛋白质。鉴定动物种类利用红色箭头所示的带。 黄色箭头所示的带为胰蛋白酶处理后,观察动物之间的谱图差异。 图4针对各蛋白质带进行胰蛋白酶处理所得的 MALDI-TOF MS 谱图比较 (a) Band1 Keratin II (b) Band2 Keratin I 图4针对各蛋白质带进行胰蛋白酶处理所得的 MALDI-TOF 谱图比较(c) Band3 (d) Band4 (e) Band5 然后,对羊毛、牦牛也进行了同样的测定,探索三者之间不同位置的峰谱。各自带中所得的各动物谱图非常相似,特别是山羊绒和羊毛之间,很难看出有何不同。其中在带2的 m/z2450-2750范围内发现动物种类特别的峰谱。图5所示为其谱图。 *1涂黑色的峰谱为主要峰谱 针对这些动物种类特别峰谱进行 MS/MS解析,推测氨基酸排列,结果如表1所示。由23个氨基酸组成的肽当中,山羊绒与羊毛之间有1个氨基酸不同,山羊绒与牦牛之间有4个氨基酸不同。 在大多数纤维产品的加工工序当中,均进行了漂白、脱色、染色等化学处理,但是动物毛发的特别峰谱位置并不会因这些处理而发生改变,也可用于鉴定纤维产品中的动物毛发。 4.一根毛发的分析 分析纤维产品中的动物毛发时,为避免产品中的构成偏差,希望从大范围的产品当中进行抽样平均,使用其中的一部分。因此很少会要求进行微量分析。另一方面,分析混入食品等中的毛发时,则希望以尽可能少量的试样进行分析。 很多科学调查均是通过毛发的 DNA分析,获得血型等可以确定个人的信息。但是,纤维产品中所使用的动物毛发多为羽干部分,特别是大量染色的产品,很多时候难以分析 DNA。 由于MALDI-TOF MS 法会分析蛋白质,因此即使是一根毛发也足以进行测定。 分析一根毛发时,将以1/5左右的比例进行前文所述的蛋白质提取法。提取后的处理可与通常分析法相同。图6所示为SDS-PAGE 的示例。电泳会在15分钟左右后停止,因而电泳距离短,却可清晰地确认角蛋白及角蛋白Ⅱ的带。切取该部分并脱脱后,进行胰蛋白酶处理。胰蛋白酶处理的时间为60℃下30分钟,或在37℃下进行一整夜。图7、图8所示为由此所得的各种动物谱图的示例。 图6由1根毛发提取的蛋白质的 SDS-PAGE ( 电泳时间:15分钟、凝胶大小:90×83mm、凝胶浓度:12.5%、 电泳缓冲: Tris-MOPS SDS、胰蛋白酶处 理 :37℃、一整夜1绒山羊,2绵羊,3牦牛,4安哥拉山羊, 5 骆驼,6马,7牛, ) ( 8狗,9猫,10人,11狸,12狐狸。 ) 不同动物种类的特别峰谱位置各不相同,但多数情况下,同属动物之间的峰谱出现在相同位置。山羊绒和安哥拉山羊毛等需要另外通过显微镜进行区分。表2所示为主要动物特别峰谱的峰谱位置(m/z)与跟据数据库推测的氨基酸排列。貉、狐狸、犬的主要峰谱位置相同,而狐狸、犬分别在2638、2641处观察到第二峰谱,由此可以进行判别。除这里所示的动物之外,利用基因组数据库可以推测、确认动物特别峰谱的位置。像这样仅观察m/z 2450-2750 的谱图即可确定所含动物毛发种类是 MALDI-TOFMS 法的一大特征。 图7利用一根毛发的 MALDI-TOF MS 分析所得的动物种类特别峰谱(1) 图8利用一根毛发的MALDI-TOF MS 分析所得的动物种类特别峰谱(2) 表2动物种类特别别的氨基酸排列和峰谱位置(m/z) 5.利用 MALDI-TOF MS进行动物毛发定量分析 使用多种动物毛发的纤维产品不仅要求明确动物毛发种类,还要求表示混用率。使用显微镜进行进别时,将纤维切成 0.4 mm左右,用显微镜进行观察,判别纤维的种类,数出根数。至少对1000根纤维进行此操作,同时要对100根左右的纤维测定直径,求出各纤维重量百分比。此操作需要很高的熟练程度。 MALDI-TOFMS 法作为前文所述定性分析的延伸,可根据各种动物特别峰谱的强度比轻松地求出组成。 众所周知, MALDI-TOFMS 法当中,在照射激光进行电离时,被用作电离辅助剂(基质)的低分子化合物结晶的状态会影响肽、蛋白质的电离。每次照射激光后电离状态都会产生微妙的变化,因此认为其不适宜进行定量分析。但是,分析动物毛发时,并不需要各自组分的绝对浓度,例如只要知道山羊绒和羊毛的比例即可,因此可以使用此方法。如图9所示,通过测定山羊绒、羊毛、牦牛的峰谱强度,求出其比值,即可求出组成”。 图9混纺中山羊绒峰谱比的计算方法 山羊绒峰谱比(%)= hc x 100 / (hc +hw +hy)hc= cashmere peak heighthw= wool peak heighthy = yak peak height 图10所示为测定以一定比例混合山羊绒和羊毛的标准试样时的标准曲线示例。此时,形成倾斜度为1、通过原点的直线,峰谱比几乎与组成一致。多数情况下标准曲线不会呈直线,因此需要进行校正,求出组成。此外,包含3种以上的动物毛发时,可按每2种进行标准曲线校正,而后求出整体的组成。本应用笔记中记载的谱图为MALDI-TOF MSAXIMA Performance TM 的反射子模式下获得的谱图,MALDI-8020 的线性模式下也可获得如图11所示的相同谱图、标准曲线。 图10山羊绒/羊毛混合物的标准曲线 图11线性模式(MALDI-8020)下所得山羊绒/羊毛混合物的标准曲线 市售的纤维产品当中,纤维多进行了漂白、脱色、染色等处理,而此类产产同样可采用 MALDI-TOF MS 法进行测定。此外,很多时候棉、丝绸、尼龙、聚酯等动物毛发以外的天然纤维、合成纤维也会混纺在一起, MALDI-TOF MS 法可以在不分开这些纤维的情况下,直接求出动物毛发部分的组成。 表3所示为使用 MALDI-TOF MS 出求出山羊绒和羊毛混纺品混用率的事例。多个试样含有动物毛发以外的纤维,使用显微镜法确定其组成,仅看动物毛发部分的组成的话,比较两者得出的结果是一致的。 表3显微镜法与 MALDI-TOF MS 法的分析结果比较 样品名 显微镜法 MALDI-TOF MS法 (动物毛发部分*) (校正后) Ca Ca W 样品A 18.5 81.5 15.8 84.2 样品B 12.5 87.5 15.2 84.8 样品C 21.7 78.3 21.8 78.2 样品D 90.0 10.0 89.5 10.5 样品E 22.2 77.8 21.5 78.5 样品F 10.0 90.0 6.5 93.5 *1包含天然纤维、化学纤维等动物毛发以外的纤维时,仅计算动物毛发部分的组成。 6.利用 MALDI-TOF MS 法辨别动物毛发的实际应用 2018年9月, MALDI-TOF MS 法作为国际标准(ISO)得以发表。此外,日本产业规格 (JIS)的相关工作也在进行当中。图2所示的纤维产品一系列辨别作业可在约6-8小时内完成,可同时处理10种左右的试样。如此, MALDI-TOF MS 法已经成为与显微镜法并存的新动物毛发分析法,开始在检查现场使用。 MALDI-TOF MS 法无法区分同属动物,例如山羊绒与安哥拉山羊毛,安哥拉兔毛和兔毛等,因而需要另行使用显微镜进行区分。将来,通过将常规显微镜方法与诸如 MALDI-TOF MS 方法之类的新方法相结合,有望实现更准确的动物毛发分析。 ( <参考文献> ) ( 1)大大信一、 出 村由香、佐野元昭、SEN'I GAKKAISHI、68(10) 、 a0 276 ( 2012). ) ( 2) 大大信一、出村由香、佐野元昭、吉冈阳一郎、SEN'IGAKKAISHI, 70(6)、 1 14(2014). ) ( 3) ISO20418-2 Textiles - Q u alitative and quan t itative proteomic analysis of some animal hair fibres - Part 2 : Peptide detection using MALDI- TOF MS. ) 主要特性 -线性模式(正离子) -200 Hz 固体激光、355 nm -快速导入样品的加载锁定室 -利用UV激光实现的离子源清洁功能 -结构紧凑的台式机型 -低噪音运行(<55dB) TOF-TOF 型高灵敏度 MS/MS 解析 MALDI-TOF MSAXIMA PerformanceTM 利用搭载高能量 CID 的 TOF-TOF 型 MALDI-TOF MS 高灵敏度 MS/MS测定,可鉴定蛋白质,解析分子结构。 主要特性 -配备有可进行高精度测定的反射子模式和可进行高灵敏度测定的-线性模式(正/负离子) -利用高能量 CID-MS/MS 解析分子结构 -利用 Curved Field Reflectron 机构实现高灵敏度 MS/MS - 根据粒子光学系统和同轴方向,通过照射激光实现高灵敏度 AXIMA Performance 岛津制作所株式会社在日本和其他国家的商标。 本资料中出现的名称、产品名称、服务标记和徽标是其各公司的商标和注册商标。 此外,TM、Q标志可能未在文中明确说明。 岛津应用云 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售; ) ( *本资料中的所有信息仅供参考,不予任何保证。如有变动,恕不另行通知。 ) *金泽工业大学基因组生物工学研究所 2018年,通过使用质谱分析仪MALDI-TOFMS检测动物种类特异性的兽毛肽的辨别动物毛发的方法成为ISO标准得以发表。该辨别方法也适用于一根毛发的分析,因此不仅可以防止伪造山羊绒,也可应用于羽毛和人体毛发等各种动物毛发的辨别以及食品混入异物的检查。本文中除以往标准型号的MALDI-TOF MS AXIMA Performance之外,还将向您介绍使用价格更加低廉、结构紧凑的台式MALDI-TOF MS MALDI-8020,根据ISO标准进行动物毛发纤维定性/定量的分析案例。
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