鸡肉中硝基呋喃代谢物检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2020 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 鸡肉中硝基呋喃代谢物的测定 全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；硝基呋喃代谢物 介绍 硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用。它们作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用。硝基呋喃类药物因为价格较低且效果好，曾广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌菌沙门氏菌所引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，中国卫生部于2010年3月22日将硝基呋类药药物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能违法添加的非食用物质黑名单。 2019年12月27日，硝基呋喃被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单， 并严格执行对畜禽和水产品中硝基呋喃的残留检测。本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鸡肉样品中硝基呋喃代谢物的检测。 图-1.四种硝基呋喃类代谢物结构图 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AH-30全自动均质器 耗材 HLB 固相萃取柱 (RayCure HLB， 60mg/3 mL，试剂 甲醇(优级纯)，水 衍生剂：：含2-硝基苯甲醛0.05 mol/L。称取0.075 g2-硝基苯甲醛溶于10 mL二甲亚砜，现配现用 2.样品制备 2.1标准工作曲线配置 称取5个阴性样品2g(精确到0.01g)， 分别置于50 mL 棕色离心管中，加入10 mL甲醇一水混合溶液(2+1)，用 AH-30全自动均质器均质1 min，再用5mL 甲醇一水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000 r/min 离心5 min，吸取上清液弃掉(该步骤对样品进行清洗，防止目标物对阴性样品干 2.2样品提取 向每个样品离心管中加入10 mL 0.2 mol/L盐酸溶液，用 AH-30全自动均质器均质1 min，用10mL 0.2 mol/L 盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3mL衍生剂，用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16 h。(由于硝基呋 Raykol Auto EVA-60全自动平行浓缩仪 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260，质谱检测器(MS) Agilent 6410 RC-204-36473) 盐酸溶液：0.2 mol/L。量取 17 mL浓盐酸用水定容至1000 mL 氢氧化钠溶液：1 mol/L。称取40g氢氧化钠用水溶解，定容至1000mL 扰)。向5个离心管中分别加入适量四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物最终测定浓度分别为 0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、10.0 ng/mL。再向每个离心管中加入适量混合内标标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终测定浓度均为2.0 ng/mL。 喃代谢物与蛋白质中的氨基酸结合紧密，故需要加入盐酸进行蛋白变性，长时间的恒温水浴利于目标物的析出与衍生化，注意避光保存，硝基呋喃代谢物中的化合物见光易分解) 2.3固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 HLB(RayCure， 60 mg/3 mL) 活化 甲醇 淋洗 水 洗脱 乙酸乙酯 上述衍生溶液放置至室温后，加入5 mL 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH约为7.4，4000 r/min 离心10 min，上清液(若待测样品含脂肪较多，上清液加5mL 正已烷，振荡2 min， 4 000 r/min 离心10 min吸取并弃掉正已烷) 采用Fotector plus 仪器进行固相萃取柱的净化，样液以1 mL/min 的流速通过技迩RayCure"HLB 柱(根据样品量更改上样体积)，待样液全部通过固相萃取柱后用8 mL 水洗涤固相萃取柱，弃去全部流出液。用氮气吹干技迩 RayCure"" HLB固相萃取柱5 min (若不进行吹干，下一步的洗脱无法有效地浸润固相萃取柱，导致洗脱效果变差)。用5mL 乙酸乙酯洗脱被测物于 15 mL棕色离心管中，使用Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪在40℃水浴中吹干，用样品定容溶液(10%乙腈水溶液，含0.3%乙酸)溶解并定容至1.0mL。混匀后过0.2Hm滤膜用液相色谱一串联质谱测定。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) (mL) 时间 (min) 1 清洗样品通道 CH30H 80 5 1.5 2 活化 CH30H 废液1 5 6 1.7 3 活化 H20 废液1 5 10 2.6 4 上样 废液1 1 11 11.9 5 清洗样品瓶 H20 废液1 80 2 2.7 6 淋洗 H20 废液1 8 8 1.5 7 气推 废液1 40 5 0.7 8 气推 废液1 160 80 4.8 9 清洗注射泵 CH30H 80 1 0.3 10 清洗注射泵 Eth-Ace (Et... 80 1 0.3 11 洗脱 Eth-Ace Et... 收集 1 6 6.5 12 气推 收集 20 10 1.3 13 结束 图-2 Fotector Plus 硝基呋喃代谢物固相萃取方法 3.液质检测条件 3.1液质条件 色谱柱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5rm×21 mm×150mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A： 0.3%甲酸水溶液，B：0.3%甲酸乙青溶液 柱温 35℃ 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 3.2液相洗脱梯度 时间/min 流动相A(0.3%甲酸水溶液) 流动相B(0.3%甲酸乙腈) 0.0 80% 20% 3.0 50% 50% 8.0 50% 50% 8.1 80% 20% 16.0 80% 20% 3.3 MRM 参数 表-1.4种呋喃代谢物的串联质谱检测参数(具体数值请参考标准) Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage AMOZ 335 291 40 120 18 7 128 40 120 16 7 SEM 209 192 40 115 17 7 166 40 115 12 7 AHD 249 134 40 120 18 7 178 40 120 12 7 AOZ 236 134 40 125 14 7 192 40 125 19 7 3.4色谱图 图为4种硝基呋喃代谢物的衍生物(5 ppb) 在液质色谱中的质谱图： 4.方法可行性验证 样品基质加标回收实验 为了验证该方法的回收率，本实验向鸡肉样品(2g)中加入上述4种呋喃代谢物标准品(20uL，100 ug/L)， 进行加标回收验证。测试结果如表-2 所示。四种硝基呋喃代谢物的回收率在94.5-110.5%之间， RSD 值2.1-5.2%之间。 表-2.新鲜鸡肉的加标回收率及 RSD值(2pg/kg) 化合物(Compound) 加标量 (ng/g) 平均回收量 平均回收率(%) RSD (%) AMOZ 2.0 1.94 97.0 3.6 AOZ 2.0 2.21 110.5 5.2 SEM 2.0 1.89 94.5 2.1 AHD 2.0 2.05 100.3 2.6 5.结果与讨论 硝基呋喃代谢物容易与蛋白多肽链上的羧基键合，因此需要加入浓盐酸进行蛋白组织破坏及酰基水解。另一方面，加入硝基苯甲醛进行衍生化，可增大被测物的分子量，进而避免样品基质中小分子杂质对待测物的干扰。 衍生化反应生成的席夫碱处在过酸或过碱的条件下均容易发生分解，因此在避光衍生化16h后，需要将反应液中和至 pH=7.4左右，然后进行固相萃取净化。 6.总结 本解决方案操作方便、提取和浓缩效率高、回收率好。AH-30全自动均质器可以自动完成16个样品均质，均质后能够自动清洗刀头，清洗刀头时可以采用水洗、超声洗和溶剂洗等多级清洗组合，有效防止交叉污染，且全程无需人工干预； Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪通过独特的针自动追随液面技术可以极大地减少氮气使用量，同时避免手动氮吹需要经常去调节氮吹针高度带来 AMOZ 化合物的极性较强，因此需要控制上样速度在1 mL/min 左右，否则 AMOZ衍生物容易穿透固相萃取柱，导致其在液质上的响应值下降。若上样速度大于2 mL/min， AMOZ 的质谱信号将过低，导致其在仪器上无法被检出。 样品(空白，待测样，工作曲线等)衍生化过程中，需要加入合适的内标进行跟踪反应，避免反应过程中个别样品的衍生化失败，导致测试结果的假阴性。 的麻烦； Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。能良好的按照国标完成鸡肉样品中硝基呋喃代谢物的检测。 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 邮箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com热线： 热线：箱：info@raykol.com网址：：ywww.raykol.com 硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用。它们作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用。硝基呋喃类药物因为价格较低且效果好，曾广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，中国卫生部于2010年3月22日将硝基呋喃类药物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能违法添加的非食用物质黑名单。2019年12月27日，硝基呋喃被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单，并严格执行对畜禽和水产品中硝基呋喃的残留检测。本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鸡肉样品中硝基呋喃代谢物的检测。