肉制品中SEM代谢物检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-F007 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定肉制品中硝基呋喃代谢物 硝基呋喃类药物在人类疾病治疗上也有一定的应用。呋喃妥因(呋喃坦啶)为抑菌剂，多数大肠杆菌、肠球菌对其敏感。呋喃唑酮(痢特灵)口服吸收少，肠内浓度高。主要用于细菌性痢疾和旅游者腹泻。呋喃它酮内服后在肠道不易吸收，故主要用于肠道感染，也可用于球虫病、火鸡黑头病的治疗。呋喃西林临床仅用作消毒防腐药，用于皮肤及粘膜的感染，如化脓性中耳炎、化脓性皮炎、急慢性鼻炎、烧伤、溃疡等。对组织几乎无刺激，脓、血对其消毒作用无明显影响。 硝基呋喃类因为价格较低且效果好，而广泛应 用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，个别国家已经禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，并严格执行对水产品中硝基呋喃的残留检测。 本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鸡肉样品中国硝基呋喃代谢物的检测。 图-1.四种硝基呋喃类药物结构图及其代谢物简称 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；硝基呋喃代谢物 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 HLB 固相萃取柱(Oasis， 60mg/3mL) 高效液相色谱 (HPLC) Agilent 1260，质谱检测器 (MS)Agilent 6410 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 甲醇(优级纯)，水 3.样品制备 3.1标准工作曲线配置 称取5个阴性样品2g(精确到0.01g)，分别置于 50 mL 棕色离心管中，加入10 mL甲醇一水混合溶液(2+1)， 均质1 min， 再用5mL甲醇一水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000 r/min 离心5 min， 吸取上清液弃掉(该步骤为对样品进行清洗， 衍生济：：含2-硝基苯甲醛 0.05 mol/L。称取0.075g2-硝基苯甲醛溶于10 mL二甲亚砜，现配现用 盐酸溶液： 0.2 mol/L。量取 17 mL 浓盐酸用水定容至1000 mL 氢氧化钠溶液：1 mol/L。称取 40g氢氧化钠，用水溶解，定容至1000mL 防止目标物对样品检测产生干扰)。向5个离心管中分别加入适量四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物最终测定浓度分别为0.5ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0ng/mL、10.0 ng/mL.再向每个离心管中加入适量混合内标标准溶液，使四种硝基喃代谢物内标物最终测定浓度均为2.0 ng/mL。 3.2样品提取 向每个样品离心管中加入10 mL 0.2 mol/L盐酸溶液均质1 min， 以 10 mL盐酸溶液(0.2mol/L)洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3 mL衍生剂，用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应 16 h。(由于硝基呋喃代谢物与蛋白质中的氨基酸结合紧密，故需要加入盐酸促使蛋白变性，长时间的恒温水浴利于目标物的析出与衍生化，注意避光保存，硝基呋喃代谢物中的化合物见光易分解) 3.3 固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 HLB (Waters， Oasis， 60 mg/3 mL) 活化 甲醇当子 淋洗 水溶液 洗脱 乙酸乙酯 上述衍生溶液放置至室温后，加入5mL 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液pH约为7.4， 4000 r/min 离心10 min， 上清液(若待测样品含脂肪较多，上清液加5 mL正已烷，振荡2 min， 4000 r/min 离心10 min 吸取并弃掉正已烷) 采用 Fotector Plus 仪器进行固相萃取柱的净化，样液以1 mL/min 的流速通过 Oasis HLB 柱(根据样品量进行更改上样体积)，待样液全部通过固相萃取柱后用8mL水洗涤固相萃取柱，弃去全部流出液。用氮气吹干 Oasis HLB 固相萃取柱5 min(若不进行吹干，下一步的洗脱无法有效地浸润固相萃取柱，导致洗脱效果变差)。用5 mL乙酸乙酯洗脱被测物于15mL棕色离心管中，使用氮气吹干仪在40℃水浴中吹干，用样品定容溶液(10%乙腈水溶液，含0.3%乙酸)溶解并定容至1.0 mL。混匀后过0.2 um 滤膜，液相色谱一串联质谱测定。 序号 命令 溶剂 排出 流速[mL/minJ 体积(L 时间min) 1 清洗样品通道 CH30H 80 5 1.5 2 活化 CH30H 废液1 5 6 1.7 3 活化 H20 废液1 5 10 2.6 4 上样 废液1 1 11 11.9 5 清洗样品瓶 H20 废液1 80 2 2.7 6 淋洗 H20 废液1 8 8 1.5 7 气推 废液1 40 5 0.7 8 气推 废液1 160 80 4.8 9 清洗注射泵 CH30H 80 1 0.3 10 清洗注射泵 Eth-Ace(Et... 80 1 0.3 11 洗脱 Eth-Ace Et... 收集 1 6 6.5 12 气推 收集 20 10 1.3 13 结束 图-2 Fotector Plus 硝基喃代谢物固相萃取方法 4.液质检测条件 4.1色谱柱条件 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 具体洗脱请见国标 4.2 MRM参数 表-1.4种呋喃代谢物的串联质谱检测参数(具体数值请参考标准) Compound Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Name Energy Voltage 335 291 40 120 18 7 AMOZ 128 40 120 16 7 SEM 209 192 40 115 17 7 166 40 115 12 7 AHD 249 134 40 120 18 7 178 40 120 12 7 AOZ 236 134 40 125 14 7 192 40 125 19 7 4.3色谱图 下图为4种硝基呋喃代谢物的衍生物(5ppb)在液质色谱中的质谱图： 5.方法可行性验证 样品基质加标回收实验 为了验证该方法的回收率，本实验向鸡肉样品(2g)中加入上述4种呋喃代谢物标准品(20uL， 100 ug/L)，进行加标回收验证。测试结果如下表所示。四种硝基呋喃代谢物的回收率在 94.5-110.5%之间， RSD 值2.1-5.2%之间。 化合物(Compound) 加标量(ng/g) 平均回收量 平均回收率(%) RSD(%) AMOZ 2.0 1.94 97.0 3.6 AOZ 2.0 2.21 110.5 5.2 SEM 2.0 1.89 94.5 2.1 AHD 2.0 2.05 100.3 2.6 6.结果与讨论 6.1硝基呋喃代谢物容易与蛋白多肽链上的羧基键合，因此需要加入浓盐酸进行蛋白组织破坏及酰基水解。另一方面，加入硝基苯甲醛进行衍生化，可增大被测物的分子量，进而避免样品基质中小分子杂质对待测物的干扰。 6.2衍生化反应生成的席夫碱处在过酸或过碱的条件下均容易发生分解，因此在避光衍生化16h后，需要加入适量碱性将反应液中和至 pH=7.4左右，然后进行固相萃取净化。 7.仪器特征优势 本方法可实现肉制品中硝基呋喃代谢物从样品提取到样品净化过程全自动化，样品提取过程只需将样品和溶剂放置离心管中，通过 AH-30全自动均质仪快速均质提取，该设备解放实验室人员束缚，有效地提高实验室效率；经均质提取完的提取液利 6.3 AMOZ 化合物的极性较强，因此需要控制上样速度在1 mL/min 左右，否则 AMOZ衍生物容易穿透固相萃取柱，导致其在液质上的响应值下降。若上样速度大于2 mL/min，AMOZ 的质谱信号将过低，，-导致其在仪器上无法被检出。 6.4样品(空白，待测样，工作曲线等)衍生化过程中，需要加入合适的内标进行跟踪反应，避免反应过程中个别样品的衍生化失败，导致测试结果的假阴性。 用 Fotector Plus 全自动固相萃取仪进行净化，告别样品量多和人为操作的烦恼；净化完的洗脱液通过Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪对其进行浓缩，此过程无需样品转移，便可直接对其进行浓缩，其设计大大减少了样品损失。 ERayKol RayKol 全自动均质器样品提取 全自动固相萃取仪 全自动浓缩仪 样品净化 样品浓缩 热线：址： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com 本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鸡肉样品中国硝基呋喃代谢物的检测。