含冠状病毒特异性RNA和SARS-CoV-2特异性RNA的样本中qPCR检测方案(PCR)

analytikjenaAn Endress+Hauser Company qTOWERG 上进行新型冠状病毒 SARS-C0V-2 的qPCR检测 市面上有众多的新冠病毒 qPCR 检测试剂盒，本应用方案采用韩国 Seegene公司的Allplex 2019-nCoV检测试剂盒在耶拿荧光定量 PCR仪 qTOWERG 上进行样品检测，获得符合预期的结果。 韩国 Seegene 公司生产的 Allplex" 2019-nCoV检测试剂盒基于多重 qPCR的检测方法，如表1所示。使用不同荧光染料标记的探针可以同时检测冠状病毒特异性 RNA 和新冠病毒 SARS-CoV-2 特异性RNA，以及内质控基因。本方案中使用耶拿公司的InnuPure C16 自动核酸提取仪与 InnuPREP 病毒 DNA/RNA 试剂盒进行样本核酸的提取纯化。10ml阳性对照(RP-VPK)作为样本，加入400mlPBS 缓冲溶液， 洗脱体积为100ml。所有RT-qPCR 扩增均在20uL反应体系中进行，并根据试剂盒说明书的指示制备 PCR 反应体系。从阳性样本拭子中提取RNA， 并进行三种不同浓度的稀释，同时与 NTC 进行检测。 表1： A1lplex"2019-nCoV 中包含的探针和 qTOWERG 对应的荧光检测通道 Target sequence Specificity Probe fluorophore qTOWER configuration E gene Sarbecovirus FAM Color module 1 RdRP SARS-CoV-2 CalRed 610 Color module 4 N gene SARS-CoV-2 Quasar 670 Color module 5 Internal control Internal control HEX Color module 2 注：当阳性对照和内参显示 Ct 值≤40，同时阴性对照为阴性时，则认为检测结果是有效的。 4 steps scan °C m：s goto loops ▲T(C) At(s) 7(C/s) 45x[ 1 50，0 20：00 -- --- --，- --- 8.0 2 95，0 15：00 --- --- 8，0 3 94，0 00：15 --- 6.0 4 58.0 00：30 3 44 -- 6.0 5 6 7 8 9 10 图1：在qTOWER软件上设置的反应程序 检测结果： 稀释后的阳性对照在新冠病毒靶基因E基因、N基因、RDRP基因以及内质控 IC 的相应检测通道中均检出有效Ct 值。阴性对照在四个检测通道中均表现为阴性。 故本次实验有效。 从提取的阳性样本(绿色曲线)检测到IC、E基因、N基因和 RDRP 基因都有有效 Ct 值。 因此，该样品可判定为阳性。 图2和表2：新冠病毒特异性E基因在 FAM 通道中的检测结果 图3和表3：新冠病毒特异性 RdRP 基因在 ROX 通道中的检测结果 图4和表4：新冠病毒特异性N 基因在 Cy5 通道中的检测结果 Well Sample name ▲ Sample type Dye Gene Ct Mean Ct Std.Dev. Ct G2 NTC HEX_2 No Ct G3 NTC HEX_2 No Ct B2 1 Positive control HEX_2 17，31 17，31 0 C2 1： 10 Positive control HEX 2 20，36 20，36 0，01 C3 1：10 Positive control HEX_2 20，35 20，36 0，01 D2 1：100 Positive control HEX 2 23，19 23，2 0，01 D3 1：100 Positive control HEX_2 23，21 23，2 0，01 C5 Sample 2 Unknown HEX_2 22，61 22，22 0，55 C6 Sample 2 Unknown HEX_2 21，83 22，22 0，55 图5和表5：内质控基因在 HEX 通道中的检测结果 使用不同荧光染料标记的探针可以同时检测冠状病毒特异性RNA和新冠病毒SARS-CoV-2特异性RNA，以及内质控基因。本方案中使用耶拿公司的InnuPure C16自动核酸提取仪与InnuPREP病毒DNA/RNA试剂盒进行样本核酸的提取纯化。10µl阳性对照(RP-VP K)作为样本，加入400µl PBS缓冲溶液， 洗脱体积为100µl。所有RT-qPCR扩增均在20μL反应体系中进行，并根据试剂盒说明书的指示制备PCR反应体系。从阳性样本拭子中提取RNA，并进行三种不同浓度的稀释，同时与NTC进行检测。 稀释后的阳性对照在新冠病毒靶基因E基因、N基因、RDRP基因以及内质控IC的相应检测通道中均检出有效Ct值。 阴性对照在四个检测通道中均表现为阴性。 故本次实验有效。