新型冠状病毒核酸中qPCR检测方案(核酸提取仪)

analytikjenaAn Endress+Hauser Company CyBio Felix完成自动体系构建并在qTower上进行新冠病毒的 qPCR 检测 通过 qPCR方法来检测新型冠状病毒 SARS-COV-2 作为诊断的标准方法已经在全球广泛应用，市面上有众多的新冠病毒检测试剂盒，配合合适的荧光定量PCR仪，可快速准确地对样品进行检测判定。 新冠疫情在全球仍处于上升趋势，这不仅对于强大和可靠的检测系统提出高要求，同时对于大量样品的加样移液也提出了更高的要求，不仅要速度快，还要保证避免加样操作错误的风险，尤其是在身着厚重防护服的情况下长时间进行加样，难度相当大。 因此，，一一台高效且稳定可靠的自动化加样工作站就显得尤为必要。自动化的 PCR体系构建方式可以保证重复性并且减少交叉污染，避免加样错误。CyBioFeliX 的自动化 qPCR 体系构建解决方案可以为操作人员提供高通量，高质量的加样结果。 本应用方案采用的是复星医药公司的 COVID-19RT-PCR 检测试剂盒以及耶拿公司的 qTOWER荧光定量 PCR仪进行四重的新冠病毒的检测，， 同时展示了一个通过灵活的自动化系统 CyBio FeliX来实现 PCR 体系构建的过程。 方案详情： 复星公司 COVID-19 的 RT-PCR 检测试剂盒是一种基于 TaqMan 探针的多重荧光定量 PCR 检测试剂盒。采用标记有不同荧光染料的特异性探针能够用来检测 SARS-CoV-2的两个特异性基因以及冠状病毒特异性 RNA 序列，此外还增加了内质控的检测。 为了验证该试剂盒与 qTOWER实时荧光定量 PCR 仪的适用性，将试剂盒中的阳性对照稀释成三个不同浓度，并加上一个仅有内质控的阴性对照。 表1. qTOWER3 每个检测通道所对应的基因 Target sequence Specificity Probe fluorophore qTOWERconfiguration ORFlab SARS-CoV-2 FAM Color module 1 N gene SARS-CoV-2 JOE Color module 2 Egene Sarbecovirus ROX Color module 4 Internal control Internal control Cy5 Color module 5 在 qTOWER 荧光定量 PCR 仪上设置的反应程序和检测通道信息如图1和图2所示 6 steps scan °C m：S goto loops AT(C) At(s) z(oC/s) 5x 40x 1 50，0 15：00 -- --- --- 8，0 2 95，0 03：00 -- --- --- 6.0 3 95，0 00：05 -- --- --- 6，0 4 60，0 00：40 3 4 6，0 5 95，0 00：05 --= --- 8.0 6 60.0 00：40 5 39 --- 6，0 7 8 9 10 图1.qPCR反应程序 Dye Gain Measurement Pass.Ref. 1 Blue FAM 5 2 Green JOE 5 4 Orange ROX 5 5 Red Cy5 5 图 2. qPCR检测通道的设置 本实验还对 qPCR 体系构建过程中的手动加样和自动加样效果进行了比较，自动加样采用的是自动化移液系统 CyBio FeliX，【， 三主要配置如下： · CyBio FeliX Basic Unit with enclosure · CHOICE Head ·8-Channel CHOICE Adapter； 10uL-1000u L uL CyBio FeliX 以无需人工干预的方法自动执行所有步骤。 实验结果 以10倍梯度稀释试剂盒中的阳性对照，稀释三个不同梯度。所有目标基因 ORF1ab， N基因，E基因均有效检出，R²都在0.995以上的可靠值范围。以下是 qPCR检测结果，其中左图为 CyBio FeliX 加样结果，右图为手工加样结果。 JOE (Sars-CoV-2) target N gene in color module 2 JOE (Sars-CoV-2) target N gene in color module 2 Figure 3A*： PCR Efficiency of the N gene amplification. Figure 3B*： PCR Efficiency of the N gene amplification. Figure 4A： Amplification of Sarbecovirus-specific N gene uponautomated qPCR setup by CyBio FeliX. 5id.Dev.CE LS 30 26 30CydeFigure 4B： Amplification of Sarbecovirus-specific E gene uponmanual qPCRsetup.Wel Sarole naee - Sample type Dyw Gene Ct MmanCt StDev.CECone haCtA13 L-Man68 Postvecoetd E6ee 23.89 21.89 AI2 MorualPooilivecoel Etot 27.76 270 1.20 L：30-Mananl lomtve oo EEre 27.2 ZJA8 139 Manual Poatve coet ECone 21.50 21.15 1.12 RCC ESri 21.02 21.15 2.12 vfhtCMoruol Miogelivtcantsol nos Etone NoCt MthICVaranl Megatywcanbsol ROE EEere hia Ct Table 4B： Detection of Sarbecovirus E gene in ROX channel. ROKEGene m 30- IR： 1 27，5 Scpe -3.62 25- Cfeet 37.75 POR Effidency 0.89 2 2.5 3 3.5 Log std.Conc. Log Std. Coac. Figure 4A*： PCR Efficiency of the E gene amplification. Figure 4B*： PCR Efficiency of the E gene amplification. 从结果可看出，复星公司 COVID-19RT-PCR 检测试剂盒可与耶拿公司的qTOWER配合使用，检测到的结果全部符合说明书中的检测标准。 手动加样和自动工作站 CyBio FeliX 完成相同样本的 PCR 体系构建，其结果 Ct 值非常相似，即都能在 qTOWER3平台上获得高质量的检测结果。考虑到实际工作中检测样品量会远远多于此次实验，自动化工作站在大量样品的情况下还是具有稳定、不易出错的优势。 复星公司COVID-19的RT-PCR检测试剂盒是一种基于TaqMan探针的多重荧光定量PCR检测试剂盒。采用标记有不同荧光染料的特异性探针能够用来检测SARS-CoV-2的两个特异性基因以及冠状病毒特异性RNA序列，此外还增加了内质控的检测。为了验证该试剂盒与qTOWER³实时荧光定量PCR仪的适用性，将试剂盒中的阳性对照稀释成三个不同浓度，并加上一个仅有内质控的阴性对照。从结果可看出，复星公司COVID-19 RT-PCR检测试剂盒可与耶拿公司的qTOWER3配合使用，检测到的结果全部符合说明书中的检测标准。手动加样和自动工作站CyBio FeliX完成相同样本的PCR体系构建，其结果Ct值非常相似，即都能在qTOWER³平台上获得高质量的检测结果。考虑到实际工作中检测样品量会远远多于此次实验，自动化工作站在大量样品的情况下还是具有稳定、不易出错的优势。