单细胞中分离与孔板成像检测方案(单细胞分析仪)

APPLICATION NOTE全国咨询服务热线：400-820-3586上海每 电话：86-21-33721088北京 电话：86-10-64108669成都 电话：86-28-65588820台北匕 电话：886-2-26567585香港 单细胞分离与孔板成像组合的高效细胞株开发流程 Sarmad Al-Bassam， PhD|Applications Scientist|Molecular Devices 引言 在生物药物分子(如抗体)的生产过程中细胞株开发及单克隆性确认是非常关键的步骤。细胞株开发起于将表达目的蛋白的基因转入宿主细胞。通过分离高效表达目的蛋白的单个活细胞即可建立细胞株。在这个过程中，单克隆性的记录至关重要，用于确保细胞株的基因重现性。随后的步骤涉及细胞克隆的产量、质量和稳定性的表征(图1)。 当前细胞株开发的工作流程有一些局限，如低细胞活率、低效的单细胞分离以及有限的单克隆性证据。有限稀释，一种传统分离单细胞的方法，依赖于统计概率，无法提供单克隆性的可视化证据。此外，该技术的效率非常低，最终导致每块微孔板上可供筛选的克隆非常少。 CloneSelectTM 高通量单细胞分离系统是一个新颖的台式设备用于柔和精确地从液体样品中分离出单个活细胞。单细胞分离系统采用微流控分离槽以精确地分离单个细胞，同时最小化分离不同细胞可能带来的交叉污染的风险。当单细胞分离系统与 CloneSelectTM Imager (CSI) 细胞生长分析系统的快速成像技术配合，可以显著提高细胞株开发流程的效率。 这里，我们将介绍结合单细胞接种和单克隆性验证的工作流程。我们利用单细胞分离系统和 CSI 接种单细胞至微孔板，然后确认这些细胞的存在并记录他们在随后几天里的生长过程。最后，我们将介绍如何生成包含单克隆性证据的文件用于提交监管机构审批。 分离槽和微孔板水平的成像和效率静置待细胞沉降至孔底后用 CSI 或 CSI-FL对微孔板成像。检查每个孔保存的喷嘴图像以计算单细胞分离的效率。为了在微孔板水平计算单细胞分离的效率，在有限稀释或单细胞分离前用荧光染料(1 uM CalceinAM， Molecular Devices) 标记 CHO-K1。用CSI-FL对微孔板成像，并利用细胞计数功能计算细胞数目。在第10天评估单细胞孔的活率，其他孔的数据排除分析。 图1细胞株开发的典型工作流程。 优势 ·单细胞分离效率>80% 提高单细胞克隆成活率，同时降低交叉污染风险 轻松生成单克隆性文件 ( ·简单的向导式报告功能，包括导出细胞区域、杂质区域以及全孔 ) 仪器概览和工作流程 单细胞分离 单细胞分离系统是一款新颖的桌面型设备用于柔和并精确地从液体样品中分离出单个活细胞。系统利用一次性的分离槽，因此在分离不同细胞时最小化交叉污染的风险。一个分离槽单次运行可接种细胞至多块96孔板或384孔板。为了接种单细胞，单细胞分离系统采用压电驱动器产生微小液滴(图2A)。一个高分辨的相机连续对分离槽的喷嘴部位采集图像，与此同时图像算法分析喷嘴末端区域以检测是否存在单个细胞。当液滴中含有零个或多个细胞时，真空泵工作将液滴吸走。当算法确认是单个细胞时，真空泵被关闭，包裹单个细胞的液滴落入微孔，单细胞分离系统的打印头移至下一个微孔。 分离槽喷嘴水平的单克隆性证据 分离槽的喷嘴部位采用高景深的相机成像以实现>99%的细胞被聚焦。当检测到液滴中含有单个细胞时，连续的5张图片会被采集以跟踪单个细胞直至离开喷嘴末端(图2B)。图像1-3在液滴形成前采集，图像5显示液液挤出后的喷嘴。图像4中叠加用户设定的圆形区域，为单细胞事件设定界限。喷嘴水平的图像可作为微孔板图像的补充。我们观察到喷嘴图像和孔板图像之间有着非常高的相关性98.9%±1.8(n=282个孔)。 CSI 轻松完成微孔板成像和单克隆性报告 CSI可实现快速一致的微孔板成像。可在90s内完成一块96孔孔板 384孔板的成像。分析算法基于白光图像可以无标记定量地分析细胞细合度 (confluence)。在本次实验流程中，经有限稀释或单细胞分离系统制备的细胞孔板被 CSI 跟踪观察超过10天。在孔板缩略图标签页，绿色为细胞克隆。点击单个孔会切换至图像浏览标签页，在这里可以查看全孔水平上的克隆(图3A)。 Loci Count 标签页可以设定克隆区域和圆度以精确地计数克隆数目(图3B)。点击单孔后可以优化克隆计数的参数，然后回到全板视图。报告生成标签页可用于为单个孔生成报告，包含第0天起的各个时间点(图3C)。在这个界面可以为每个时间点设定细胞区域(绿框)。示例中的细胞含有5个时间点。软件允许调整细胞区域的位置以保证细胞及细胞团出现在框选区域的中间。 A 图22CloneSelectTM 单细胞分离系统的技术原理。(A)分离槽加入细胞样品后安装至单细胞分离系统，然后开启单细胞分离工作。在分离过程中，压电驱动器持续工作产生微小液滴。含有零个或多个细胞的液滴被喷嘴下方的真空泵吸走。鉴定为单细胞事件时，真空泵被自动关闭，液滴掉落至微孔内。(B)当鉴定为单细胞事件时，系统会采集五张图像作为喷嘴水平的单克隆性证据。图像1-3显示液体挤出前存在的单个细胞，图像4叠加分析区域和单细胞，图像5显示液滴挤出后喷嘴的情形。 图3 CloneSelectImager 的孔板成像，细胞克隆表征和报告生成。(A)单细胞分离系统处理的微孔板在第10天用 CSI 成像。孔板缩略图 (Plate Thumbnails) 可以显示细胞克隆。点击单孔会导航至导览界面 (ViewImage)，从中可以查看全孔图像。(B)在 Loci Count界面通过调节克隆面积和圆度优化克隆的计数分析。(C) 在 Generate Report 界面可添加细胞区域(绿框)并调节不同时间点的位置，最终展示单个细胞生长成克隆的过程。 利用报告功能轻松记录单克隆性 CSI 的报告生成功能利用向导式的软件可以快速设置、自定义报告并最终提交监管机构。用户可以用两种方式阐明孔内不存在第二个细胞：1)显示所有区域的时间序列图像(图4A)；2)展示可疑物体的时间序列图像(图4B)。因为类似细胞的碎片会使确切评估第0天的单克隆性变得困难，圈定碎片区域并展示时间序列证明其没有发生分裂可以增强判断信心。 结果 单细胞分离系统和有限稀释接种单细胞的效率 为了评估单细胞分离系统接种单细胞的效率，我们分析了分离槽喷嘴的图像以确认液滴进入微孔前都观察到了单个细胞。基于喷嘴区域的图像分析，单细胞分离系统实现了88.5%±5.5(n=9块微孔板)的单细胞接种效率。两个细胞和零个细胞发生的比例非常低(分别为6.7%和4.8%)。每块96孔板的平均处理时间为8.1±2.8分钟。如示意图所示(图5A)，经单细胞分离系统处理的一块96孔板中含有85个单细胞孔，6个多细胞孔和5个空孔。 相对地，0.5个细胞/孔的有限稀释理论上可以得到30%的单细胞孔，10%的多细胞孔和60%的空孔。如示意图所示(图5B)，有限稀释处理的一块96孔板可以产生28个单细胞孔，10个多细胞孔以及58个空孔。图5C直接比较了单细胞分离系统和有限稀释产生空孔、单细胞孔和多细胞孔的比例。相比有限稀释，单细胞分离系统将单细胞接种的效率提升了~3倍，这意味着有更多潜在的克隆可被下游分析。 克隆成活率 我们比较了单细胞分离系统和有限稀释的单细胞克隆成活率。为了计算活率，我们将有限稀释或单细胞分离系统处理的微孔板放入CSI定期成像直至第10天形成明显的克隆。图6A为经单细胞分离系统处理的一块代表性微孔板在第10天的图像，从中可见单克隆的孔占据明显的多数(共70个孔)。相对地，图6B为有限稀释处理的微孔板，其中仅有27个单克隆的孔。 图4生成报告证明有且只有一个细胞。(A)报告可以包含所有区域的时间序列图像。(B)报告中还可以包含碎片杂质区域。通过导出碎片杂质的时间序列图像，可以以明这些物体不是活细胞亦没有发生细胞分裂。 A 单细胞分离系统 图 5 比较单细胞分离系统和有限稀释的单细胞接种效率。(A)经单细胞分离系统处理的微孔板图例，其中85个孔含有单细胞，6个孔含有多个细胞以及5个孔不含细胞。(B)有限稀释处理的微孔板图例，其中28个孔含有单个细胞，10个孔含有多个细胞以及58个孔不含细胞。(C)单细胞分离系统单细胞接种的效率与有限稀释的理论计算效率相比较，前者在单细胞接种效率上较后者提高了大约3倍。 计算每个孔内的克隆数目并分成3类：空孔，单个克隆的孔以及多个克隆的孔。我们观察到单细胞分离系统可以产生63.0%±6.5的单克隆孔(另外有1.5%±1.4的孔含多个克隆，35.5%±7.3的孔没有克隆)。同时，我们发现有限稀释可以获得26.2%±2.3的单克隆孔(另外66.4%±3.9的孔没有克隆，7.4%±1.9的孔含多个克隆)。图 6C比较了单细胞分离系统和有限稀释获得单克隆孔的比例。 为了直接检测单细胞的活率，荧光染料标记的细胞被用于实验并采集第0天的图像，随后继续培养10天。将给定微孔板的单克隆孔的数目除以单细胞孔的数目就能得到活率。我们发现单细胞分离系统的平均活率为84%，而有限稀释的平均活率为81%。 采用类似方法，我们比较了单细胞分离系统接种不同细胞株时的活率(图6E)。般而言，CHO， HEK 以及其他常见细胞株的典型活率超过 75%。需要注意的是不同细胞株类型、样品制备过程、分离参数设定、培养基以及其他外部因素会对细胞活率产生影响。 总结 在这里我们介绍了 CloneSelect 单细胞分离系统和CloneSelect Imager (CSI)细胞生长分析系统组合应用的工作流程，它可以提高单细胞接种的效率并记录单克隆性。单细胞分离系统在高效快速接种单细 C 图6 比较单细胞分离系统和有限稀释的细胞活率。(A)经单细胞分离系统处理的微孔板在 第10天的克隆图像。70个孔含有单个克隆，1个孔含有两个克隆，而25个孔不含克隆。(B)有限稀释处理的微孔板在第10天的克隆图像。27个孔含有单个克隆，7个孔含有多个克隆，而62个孔不含克隆。(C)对有限稀释和单细胞分离系统单细胞分离得到的微孔板中的克隆成活百分比作图。(D)比较有限稀释和单细胞分离系统在单细胞来源克隆的成活率。单细胞分离系统的平均成活率为84%，而有限稀释的对应数值为81%。(E)不同类型细胞的单细胞克隆率。 的分析变得简单，利用自动报告生成功能可以快速获得完整的单克隆性报告。在这个工作流程中，克隆形成率上的3倍提升意味着更多的克隆可进入后续的分析，从而在提高工作效率的同时节省人工和试剂成本。 更多精彩内容尽在官方微信 ( 美谷分子仪器(上海)有限公司 ) Email： info.china@moldev.com www.MolecularDevices.com.cn ( 传真：86-21-3372 1 066 地址：上海市长宁区福泉北路518号1座501室200335 传真：8 6 -10-64108601 地址：北京市朝阳区广渠东路3号中水电国际大厦612&613室100124 传真：8 6 -28-65588831 地址：成都市市江区东御街18号百扬大厦2208室610016 传真：8 8 6-2-28948267 地址：台北市内湖区堤顶大道二段89号3楼 ) 传真：852-22895385 地址：香港中环皇后大道中15号置地广场公爵大厦21楼 CloneSelectTM高通量单细胞分离系统是一个新颖的台式设备用于柔和精确地从液体样品中分离出单个活细胞。单细胞分离系统采用微流控分离槽以精确地分离单个细胞，同时最小化分离不同细胞可能带来的交叉污染的风险。当单细胞分离系统与?CloneSelectTMImager?(CSI)?细胞生长分析系统的快速成像技术配合，可以显著提高细胞株开发流程的效率。