杂交瘤细胞中筛选检测方案(流式细胞仪)

ClonePix 2系统在杂交瘤细胞筛选中的应用 .一、ClonePix 2系统简介 2 二、ClonePix 2系统在筛选杂交瘤细胞中的优势. 3 1、ClonePix 2系统的优势.. 3 2、ClonePix2系统的优异性能. 5 三、ClonePix2系统在杂交瘤细胞筛选中的应用. .7 1、筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞. .7 2、多色荧光检测筛选分泌特定类型抗体的杂交瘤细胞.. 8 3、挑取分泌抗体的杂交瘤细胞..... 8 4、挽救不稳定的杂交瘤细胞.. 四、ClonePix 2系统的更多应用 五、相关文献. 10 一、ClonePix 2系统简介 ClonePix2是最新一代的高效细胞克隆筛选系统(图1)，主要用于抗体和蛋白类药物研发，适用于杂交瘤细胞的筛选，以及稳定高表达细胞株的筛选。ClonePix系统的全球装机量已经超过300套，其中排名前十的生物制药企业都是ClonePix系统的用户。 相比涉及大量手工操作的有限稀释法，ClonePix 2系统利用半固体培养基和荧光原位成像技术允许对更多克隆进行筛选，从而更快速地获得优质克隆。在争分夺秒的抗体药物研发竞赛中， ClonePix 2系统可以帮助获得更多的时间和生产成本优势，最终获得更大的市场。 图1： ClonePix2仪器外观 二、ClonePix 2系统在筛选杂交瘤细胞中的优势 1、ClonePix 2系统的优势 相比传统的有限稀释法， ClonePix 2系统可以缩短杂交瘤细胞筛选的时间(图2)，降低筛选的成本(图3)，从而加快药物开发的进程。 传统方法 图2：有限稀稀法和ClonePix2系统筛选杂交瘤细胞的时间比较。 图3：有限稀稀法和ClonePix 2系统筛选杂交瘤细胞的成本比较。 有限稀释法是常用的克隆化方法。其基本操作如下：细胞计数并数释，按每孔0.5-1个细胞的量将细胞悬液加到孔板中培养，一段时间后就可以看到部分孔有单个克隆形成(理论上每孔的细胞个数服从泊松分布)。实际中，部分孔中或者含有不止一个克隆，或者没有克隆，真正形成单克隆的比例约30%，因此有限稀释法成克隆的效率较低，且后续需要多次亚克隆以保证单克隆性。有限稀释法需要开展大量的分析检测以筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。 ClonePix 2系统配套的半固体培养基可以提高细胞克隆的效率。半固体培养基可以阻止细胞移动，但不影响营养组分的扩散，因此可以高效地形成细胞克隆。在半固体培养基中加入荧光检测试剂，可以实现原位定量检测(图4)。ClonePix 2系统对克隆进行白光和荧光成像，软软分析后挑取目标克隆。特异性的筛选和挑取，可以极大地降低后续分析的工作量。因此， ClonePix 2系统相比有限稀释法，具有高通量、高效率的优势，节省大量时间和成本。 图4： ClonePix 2的工作流程，可以分为三个环节：(1)将细胞接种至半固体培养基； (2)细胞培养(杂交瘤细胞一般培养一周左右)；(3)放入ClonePix 2系统进行克隆挑取。 2、ClonePix 2系统的优异性能 ClonePix 2系统兼具白光成像和荧光成像，其中白光成像可以识别克隆，荧光成像则可以检测抗体的特异性或抗体的表达量(图5)。配套的分析软件可以基于克隆形态(大小、圆度、轴比、克隆间距)和荧光强度对克隆进行筛选(图6)，最后对目标克隆进行自动化高速挑取(图7)，挑取速度超过200个克隆/小时。 ClonePix2系统具备HEPA过滤，空气洁净度级别为100级，还具有层流气体、紫外灭菌、洗槽以及高温卤素灯等设置，避免污染，保证杂交瘤细胞的质量。 图5： ClonePix 2系统的白光成像(左)和荧光成像(右)。 X 图6： ClonePix 2系统的分析软件。 图7： ClonePix 2系统的克隆挑取过程。 三、ClonePix 2系统在杂交瘤细胞筛选中的应用 1、筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞 ClonePix 2系统可以实现抗原特异性杂交瘤细胞的筛选。以荧光标记的抗原为探针，结合复合物起始因子(Complex InitiationFactor)，可以原位检测表达特定抗体的杂交瘤细胞，从而一步到位获取目标杂交瘤细胞，减少后续的分析工作量。 图8：筛选抗原特异性杂交瘤细胞克隆的原理(上)和实际图片(下)。 2、多色荧光检测筛选分泌特定类型抗体的杂交瘤细胞 ClonePix2配置5组滤光片，可以实现三色荧光检测，从而同步实现抗原特异性的检测和抗体类型及产量的检测。在下图中，利用红色荧光染料标记抗IgG的抗体，检测分泌IgG抗体的杂交瘤细胞克隆，同时利用蓝色荧光染料标记抗原，检测抗原特异性的杂交瘤细胞。双色叠加，可以筛选出分泌特异性IgG抗体的杂交瘤细胞克隆。 图9：多色荧光筛选分泌特异性IgG抗体的杂交瘤细胞。 3、挑取分泌抗体的杂交瘤细胞 筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞需要预先准备荧光染料标记的抗原，有些抗原可能不便于标记，或者标记成本较高，这时可以采用“两步法”。首先使用ClonePix 2系统筛选和挑取分泌抗体的杂交瘤细胞，接着用ELISA等方法检测抗体的特异性。 4、挽救不稳定的杂交瘤细胞 杂交瘤细胞株可能出现退化，导致抗体表达量下降，这时可利用ClonePix 2系统评估杂交瘤细胞抗体表达量的稳定性，并从中挑选出高表达的杂交瘤细胞亚克隆，经过多次亚克隆可获得稳定表达的杂交瘤细胞(图10)。 A B 图10： ClonePix 22系统用于快速挽救退化的杂交瘤细胞。亲本杂交交细胞铺板，第5天挑取高表达亚克隆(左)。筛选到的高表达克隆再次铺板，成像结果显示抗体分泌水平较一致(右)。 四、ClonePix 2系统的更多应用 1、筛选稳定高表达抗体的细胞株 2、筛选表达GPCR蛋白的细胞株 3、筛选表达分泌型重组蛋白的细胞株 4、基于细胞表面分子标志物的筛选 5、基于报告基因的细胞筛选 6、干细胞筛选 五、相关文献 1. Smith S A， Nivarthi U K， De A R， et al. Dengue virus prM-specific human monoclonal antibodies with virus replicationenhancing properties recognize a single immunodominant antigenic site.[J]. Journal of Virology， 2015. 2. Percivalalwyn JL， England E， Kemp B， et al. Generation of potent mouse monoclonal antibodies to self-proteinsusing T-cell epitope “tags"[J]. Mabs， 2015， 7(1)：129-137. ( 3 . Goeij B E D ， Peipp M， H a ij S D， et al . H E R2 mon o clonal antibodies tha t do n ot interfere wi t h receptorheterodimerization-mediated si g naling in d uce effective in t ernalization and re p resent val u able components forrational antibody-drug conjugate design[J]. Mabs，2014， 6(2)：392-402. ) ( 4. S mith S A， de Alwis A R， Kose N， et al. I solation of dengue virus-specific memory B ce l ls with l i ve virus antigen fromhuman s u bjects f o llowing natural i nfection reveals the presence o f d iverse n ovel f unctional groups o f antibodyclones.[J]. 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Journal of Bi o logical Chem i stry，2011，287(52)：43482-91. ) 公司简介 Molecular Devices 始创于上世纪80年代美国硅谷，作为全球高通量仪器设备的优秀品牌，一直致力于为生命科学研究及药物研发提供先进的全方位解决方案。其产品覆盖微孔板检测分析、高通量筛选、高内涵成像、高效克隆筛选等。公司以持续创新、快速高效、一流质量的产品及完善的售后服务著著业内。 Molecular Devices 为您提供高性能的分析检测系统，加快和改进药物研发及基础生命科学的研究。除了科研单位和部门外，我们还帮助制药和生物技术企业从分子、细胞和系统水平去了解各项生物功能，研究开发新的治疗方法。 Molecular Devices 于近几年收购了 Universal Imaging Corporation (2002年)、Axon Instruments(2004年)、Blueshift Technologies (2008年)和 Genetix(2011年)，从而进一步拓展了公司的产品领域。现在，Molecular Devices 与 Leica、Sciex、Beckman Coulter、Pall等公司均隶属于 Danaher集团公司，我们的产品线包括：微孔板读板机系列、液体处理系统、电生理检测系统、神经细胞生物学仪器和软件、高内涵细胞成像系统、生物芯片扫描仪和软件、克隆挑选系统、Threshold 系统以及筛选试剂等。其中，微孔板读板机系列涵盖了光吸收、荧光强度、化学发光、荧光偏振、时间偏振荧光等测读模式以及终点检测、光谱扫描、快速和慢速动力学的检测方法。 Molecular Devices 总部位于美国硅谷中心桑尼韦尔市，并在全球设有多个代表处和子公司，包括美国、法国、英国、德国、中国、韩国、日本、巴西等。2005年， Molecular Devices 在上海设立了中国代表处， 2012年 Molecular Devices 在国内正式成立商务公司：美谷分子仪器(上海)有限公司。 扫一扫关注我们的官方微信 Molecular Devices 大中华区 Email： info.china@moldev.com www.MolecularDevices.com.cn ( 地址：北京市朝阳区广渠东路3号中水电国际大厦612&613室 100124 ) 台北 电话：886-2-26567585 传真：886-2-28948267 ( 地址：成都市锦江区东御街18号百扬大厦2208室610016 地址：台北市内湖区堤顶大道二段89号3楼 ) 香港巷 电话：852-22486000 传真：852-22486011 MOLECULARIDEVICES ClonePix 2是最新一代的高效细胞克隆筛选系统(图 1)，主要用于抗体和蛋白类药物研发，适用于杂交瘤细胞的筛选，以及稳定高表达细胞株的筛选。ClonePix系统的全球装机量已经超过300套，其中排名前十的生物制药企业都是ClonePix系统的用户。相比涉及大量手工操作的有限稀释法，ClonePix 2系统利而更快速地获得优质克隆。在争分夺秒的抗体药物研发竞赛中，ClonePix 2系统可以帮助获得更多的时间和生产成本优势，最终获得更大的市场。用半固体培养基和荧光原位成像技术允许对更多克隆进行筛选，从