微生物中克隆筛选检测方案(微生物检测)

QPix 400 系统在噬菌体展示中的应用 QPix 400 系统在噬菌体展示中的应用 一、QPix 400 系统简介 QPix 400 系列是目前全世界最专业的微生物克隆筛选系统，全球装机量超过800套。早在上世纪90年代，大规模的测序工作迫切的需要一款性能可靠的自动化微生物克隆挑选系统。Genetix 公司(现为 Molecular Devices公司)开发了Qbot 系统，它的独特的技术以及可靠的性能得到了广大用户的认可。参加人类基因组计划的8家测序中心，其中有7家将 QPix 作为标准设备。在此基础上推出的全新一代 QPix 400 系统，具有更加优异的性能。QPix 400 系统从加样到到布 ，从筛选到挑取，从管理克隆库到制作样品芯片都能实现自动化。利用配套的微生物特异性挑针，系统可以实现对细菌、噬菌体、酵母、链霉菌以及微藻等不同微生物的高效挑取，结合超声琼脂厚度探测器，可使挑选效率超过98%的。QPix 400系统的挑取速度超过3000个克隆/小时，可以很好地满足高通量实验的需求。系统配套的分析软件可以根据克隆大小、圆度、轴比、间距、荧光强度、克隆颜色以及光晕大小等参数进行筛选，更加准确地挑取目标克隆，减少无效克隆的挑取以及下游分析的工作量，从而加快项目进展。QPix 400 系统的优异表现使其在噬菌体展示、工业微生物改造、酶进化、生物燃料、合成生物学、蛋白质表达、酵母双杂交、功能宏基因组学以及文库管理等领域得到广泛应用。 QPix 400 系列包含 QPix 420， QPix 450和QPix 460，三者之间的比较见表1. 表1：QPix 400系列三个型号的比较 型号 QPix 420 QPix 450 QPix 460 仪器外观 秒 22cm QTray 1 2 2 9cm Petri dish 5 10 10 OmniTray 2 4 4 最大终微孔板数 12 210 140 最大孔板栈数 0 3 2 琼脂厚度探测器 有 有 有 条码读取器 有 有 有 涂布功能 无 无 有 荧光筛选 可选 可选 可选 点膜 可选 可选 可选 文库复制和重排 可选 可选 可选 二、QPix 400 系统在噬菌体展示实验中的应用 噬菌体展示技术(Phage Display Techniques， PDT)是二十世纪八十年代逐步建立并发展起来的一项新技术。它以噬菌体为载体，使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，它实现了基因型和表型的一对一转换，提供了高效率的筛选系统。利用噬菌体表面展示技术可以构建抗体库、随机肽库、蛋白质突变体库和cDNA 文库，从而广泛用于单克隆抗体的筛选、先导化合物的筛选、疫苗的研制，改造和提高蛋白类药物、酶和抗体的生物学和免疫学属性，尤其是在抗原表位分析、受体与配体结合位点确定等分子间识别机制的研究方面，具有广阔的应用前景。 噬菌体展示的实验流程包括噬菌体展示库构建，噬菌体淘选，噬菌体感染和扩增，噬菌体挑选，产物分析确定候选噬菌体，以及 DNA 测序等步骤。淘洗阶段包括吸附-洗脱-扩增，一般通过 3-4轮的淘洗就可以有效富集高亲和力的噬菌体。随后将这些高亲和力的噬菌体感染大肠杆菌，琼脂板铺板培养并挑选出噬菌体。最后通过检测表达产物而筛选出候选噬菌体，获得 DNA 序列后进行后续的工作。图1为噬菌体展示技术筛选候选抗体药物的实验流程示意图。在这个实验流程中，QPix 400 系统可用于噬菌体/噬菌斑挑选、高通量点样、文库重排和文库复制等步骤(图2)。系统可完整记录这些操作，包括源板 ( source plate)和终板(destination plate )的信息，居于数据追溯和检索。QPix 460系统还可以实现自动化地加样和涂布，减少手工操作，提高整体效率以及成功率。 Antibody product candidate 图1：噬菌体展示技术筛选候选抗体药物的实验流程。 图2： QPix 400 系统在噬菌体展示实验中的应用(深色方块显示)。 1、挑选噬菌体 淘选后一般可获得数千个噬菌体，手工挑选工作量巨大且容易出错(表2)。QPix 系统具有高达3000个克隆/小时的挑取速度，可以轻松满足通量的要求。QPix 配套专用于大肠杆菌/噬菌粒、噬菌斑的挑针(图3)，保证微生物样品挑取 和转移的效率。配套的分析软件可以利用克隆的大小、圆度、轴比以及克隆间距进行筛选，从而更加准确高效地获取噬菌体克隆(图4、图5、图6)。 QPix 400 系统提供多重措施亏止污染。首先整个系统提供封闭环境，实验前可用紫外灯进行灭菌操作。克隆挑取过程中可用三个洗槽对挑针进行依次清洗和灭菌，最后用卤素灯高温灭菌(图7)，防止交叉污染。 表2 ： QPix 系统挑选和手工挑选的比较 QPix挑选 手工挑选 筛选标准 软件客观分析 主观判断 挑取时间(5000个克隆) <2小时 1周 准确性 >98% 低 图3： QPix配套的挑针，用于大肠杆菌/噬菌粒和噬菌斑的挑取。 图4：QPix系统对噬菌斑成像。 图5：分析软件筛选出符合要求的噬菌斑。黄色为符合要求的待挑选噬菌斑。红色为不符合要求的噬菌斑。 图6：噬菌斑挑选后成像。较亮的小孔为挑针留下的痕迹。 图7： QPix 400 系统克隆挑取过程。 2、通量点样 在分析筛选环节， QPix 的点样功能可以制备高密度芯片，实现高通量的分析。点样功能将液体样品点到尼龙膜或 NC膜上，后续可开展点杂交实验(图8)。一张22cm×22cm 的膜上最高可以点57600个样品。在噬菌体展示实验中，按一张膜3000个样品计算，两张22cm×22cm 的膜就可以完成6000个样品的检测，相比 ELISA 或其他检测方法，点杂交的方法可以节省相当的检测成本以及检测时间，适合初步筛选以过滤大量的阴性样品。 图8： QPix的高通量点样功能。 3、文库复制和重排 QPix 400 系统支持微孔板复制和重排。通过复制功能可获得多份样品，用于多个检测项目或样品备份(图9)。重排功能可以将最后筛选到的阳性克隆归集到一起便于样品管理(图10)。 图9：微孔板样品复制。 图10：微孔板样品重排。 4、数据记录 QPix 400 系统具有完整的数据记录和检索功能，便于后续的数据追溯(图11)。 完整的样品操作记录追踪 图11：QPix 400 系统娄数据浏览功能。 5、QPix 460 涂布功能 QPix 460 具有涂布功能，可以自动吸取菌液并涂布到琼脂板上，减少手工操作及误差，提高效率和成功率。 6、QPix系统的定制和全自动化整合 除了标准型号和功能外，还可以根据需要定制 QPix系统，从而实现整个实验流程的整合和全自动化。QPix 系统可以整合机械臂、液体处理工作站、培养箱、 离心机以及酶标仪等，完成菌液处理、琼脂板涂布、琼脂板培养、克隆挑取、深孔板摇床培养、液体处理及产物检测，实现高通量、全自动化地运行。 三、QPix 400 系统的更多功能和应用 1、荧光筛选 QPix 400 系统可配置荧光成像模块，内置5组标准滤光片，从而在克隆形态筛选的基础上增加荧光强度的筛选(图12)。 图12：克隆白光成像(左)和荧光成像(右)。右图中的红圈表示不表达 GFP的细菌克隆。 2、克隆颜色筛选 有些具有特定性质或功能的微生物会呈现一定的颜色，基于颜色筛选是非常直接和有效的方法。QPix 400 系统的分析软件可基于克隆颜色进行筛选，将特定类群的微生物克隆挑选出来。目前支持蓝白斑筛选(图13)和红白斑筛选。 图13：蓝白斑筛选实例。软件会自动设定阈值，亦可以手动调节，将蓝色克隆和白色克隆区分。 3、光晕筛选 分泌特殊物质(如抗生素或水解酶等)的微生物克隆会在周边形成光晕，光晕的大小与特定物质的分泌量成一定相关性。在以获取特殊物质为目标的项目中，QPix 400 系统的分析软件可以通过分析光晕的大小将产量较高的克隆挑选出来，从而更加准确地获取目标克隆，减少克隆挑选的工作量及下游分析的工作量，加快整体项目的进展(图14)。 图14：抑菌圈筛选实例。QPix 配套软件通过分析抑菌圈的大小筛选出抗生素分泌量较高的微生物克隆。 4、更多应用 QPix 400系统还可以用于酵母、链霉菌、微藻等，广泛适用于工业微生物改造、酶进化、生物燃料、功能宏基因组学、蛋白质表达、酵母双杂交以及文库管理等(图15)。 图 15 ： QPix 400 系统的应用。 四、噬菌体展示相关文献 1. Hagemann U B， Gunnarsson1 L， Geraudie S， et al. Fully humanantagonistic antibodies against CCR4 potently inhibit cell signalingand chemotaxis.[J].Plos One， 2013， 9(7)：e103776. 2. Khattar N H. Lung cancer-associated auto-antibodies measured usingseven amino acid peptides in a diagnostic blood test for lungcancer.[J]. Cancer Biology & Therapy， 2010， 10(3)：267-72. 3. Huang Y J， Chen I C， Yu C M， et al. Engineering anti-vascularendothelial growth factor single chain disulfide-stabilized antibodyvariable fragments (sc-dsFv) with phage-displayed sc-dsFv libraries.[J].Journal of Biological Chemistry， 2010， 285(11)：7880-91. 4. Ratnikov B， Cieplak P， Smith J W. High Throughput Substrate PhageDisplay for Protease Profiling[]. Methods in Molecular Biology， 2009，539(539)：93-114. 5. Turunen L， Takkinen K， Soderlund H， et al. Automated panning andscreening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries.[]. Journal of Biomolecular Screening， 2009，14(14)：282-93. 6. Hsu H， Tsai K Y， Chang H， et al. Factor Xa Active Site SubstraiSpecificitywith SubstratePhageDisplayanddiComputationalMolecularModeling[].. JournalofBiologicaClhemistry，2008，283(18)：12343-53. 7. Zhong L， Coe S P， Stromberg A J， et al. Profiling tumor-associatedantibodies for early detection of non-small cell lung cancer.[J]. Journalof Thoracic Oncology OfficialPublicationi of the InternationalAssociation for the Study of Lung Cancer， 2006， 1(6)：513-9. 8. Martinez-Torrecuadrada J， Cifuentes G， Lopez-Serra P， et al. Targetingthe extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 withhuman single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell lineproliferation.[J]. Clinical Cancer Research，2005， 11(17)：6280-90. QPix 400 系列是目前全世界最专业的微生物克隆筛选系统，全球装机量超过800 套。早在上世纪 90 年代，大规模的测序工作迫切的需要一款性能可靠的自动化微生物克隆挑选系统。