食用菌中农药的残留量检测方案(二手分析仪器)

南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2015，46 3)：437-440ISSN 2095-1191； CODEN NNXAABhttp：//www.nfnyxb.cn ·438·南方农业学报46卷 DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2015.3.437 高效液相色谱法测定食用菌中4种农药的残留量 欧阳红军，何衍彪，林 玲* (中国热带农业科学研究院南亚热带作物研究所，广东湛江 524091) 摘要【目的】建立一种能同时检测食用菌中吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲农药残留的方法，为食用菌的安全生产提供保障。【方法】以乙腈作为提取溶剂，采用氨基柱净化后用甲醇溶剂+二氯甲烷体积比5：95)进行洗脱，用高效液相色谱二极管检测器测定，外标法定量。【结果】吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲在0.02~3.00 ug/mL的质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9992~0.9996，检出限分别为0.002、0.005、0.005和0.006 mg/kg。在3个添加水平的回收率试验中，4种农药的平均回收率为83%~106%，RSD为0.5%~3.4%。【结论】研究建立的可同时检测食用菌中吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲农药残留的方法简单、快速，且方法的灵敏度、准确度和精密度均较好，能满足农药残留分析的要求。 关键词：高效液相色谱仪；食用菌；农药残留；测定 中图分类号：N34 文献标志码：A 文章编号：2095-1191 2015)03-0437-04 Determination of four kinds of pesticide residues inedible mushrooms by HPLC OUYANG Hong-jun， HEYan biaq LNLing* (Southern Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang， Guangdong 524091， China) Abstract：【Objective】A method determining the pesticide residues of imidacloprid， acetamiprid， carbendazim anddiflubenzuron in mushrooms was established to guarantee safety production of edible mushrooms. 【Method】Acetonitrilewas added in the sample as extraction solvent. The sample was purified by NH solid phase extraction cartridge withdichloromethane+methanol eluting solvent (95：5)， and then detected by HPLC. 【Result】The results showed that a goodlinearity existed in the range of 0.02-3.00 pg/mL with the linear correlation coefficients of 0.9992-0.9996. The detec-tion limit of imidacloprid， acetamiprid， carbendazim and diflubenzuron respectively was 0.002，0.005，0.005 and 0.006mg/kg. The mean recovery rate of them ranged from 83% to 106%， and the relative standard deviation ranged from0.5% to 3.4%. 【Conclusion】The established method of determining the pesticides residue of imidacloprid， acetamiprid，carbendazim and diflubenzuron in edible mushrooms is simple， rapid， precise and sensitive， which can meet the re-quirements for pesticide residue analysis. Key words： HPLC； edible mushroom； pesticide residue； determination 0引言 【研究意义】食用菌是一种营养丰富且有一定医疗价值的食品，其能调节人体的各种生理机能，被公认为21世纪的健康食品。食用菌在栽培过程中常有病虫害发生，菇农常使用农药进行防治，给食用菌的食用安全带来了风险。我国是世界上最大的食用菌生产和出口国，食用菌的农药残留不仅给人类健康带来极 大危害，也成为影响我国食品安全和食用菌贸易出口的主要问题之之(彭卫红等，2002)。因此，快速准确地测定食用菌中的农药残留，有利于控制食用菌的质量安全，确保消费者的身体健康，提高食用菌的市场竞争力。【前人研究进展】目前主要用气相色谱、液相色谱、分光光度法等方法检测蔬菜、水果中的吡虫啉、多菌灵等农残。例如，杨立武2006)采用分光光度法对 ( 收 稿 日期 ：2 014-07 - 04 ) ( 基金项目 ：农 业部 农 业行业 标 准制定和修 订项 目农财发2011] 53 号 - 49 4) ) ( 作 者简介： * 为通讯 作者 ， 林 玲197 8-)， 副 研究 员， 主 要从事农产品检 测 与质量安全风险评估研究工作，E-mail ：27 2 557571@qq.c o m。 欧 阳红 军198 2-)， 主要从事科技开发工作，E-mail ： o yhj126@126.co m ) 各类蔬菜、水果中的多菌灵残留进行测定，结果回收率为86%~91%，检出限为0.02 mg/kg。李慧冬冬2006)用气相色谱分析法快速测定甘蓝中啶虫脒残留量，样品经乙腈提取，弗罗里硅土层析柱净化，气相色谱仪ECD检测器器定残留量，该法回收率为80.2%~99.8%，检出限为0.001 mg/kg。刘文杰等(2008)建立了一种溶剂萃取后用高效液相色谱法测定水果和蔬菜中多菌灵、吡虫啉和甲基托布津农药残留的方法，该方法利用二氯甲烷一冰乙酸作为提取剂从样品中提取多菌灵、吡虫啉和甲基托布津，液相色谱仪检测残留量，结果回收率为83%~89%，多菌灵、吡虫啉的检出限分别为0.02和0.013 mg/kg。洪月玲等(2008)建了了水果、蔬菜中多菌灵残留检测的液相色谱质谱联用 LC-MS/MS)法，该方法采用二氯甲烷和石油醚提取，用旋转蒸发器蒸至近干后用甲醇定容，过滤膜上机，结果回收率为87%~110%，检出限为0.16 ng/mL。董爱军等2010)研究建立了用分散固相萃取/高效液相色谱法测定食用菌中多菌灵残留的方法，该方法采用乙腈提取样品，提取液经十八烷基硅烷 ODS) 和乙二胺-N-丙基硅烷 PSA)吸附净化后，采用反相高效液相色谱一紫外可见检测器进行测定，外标法定量，结果回收率为81%~98%，检出限为0.03 mg/kg【本研究切入点】目前已报道的紫外分光光度法前处理繁琐，检出限高，在精度、准确度等方面无法达到要求；而气相色谱法只能测定其中的单个农药残留；质谱联用技术虽然快速、准确，但由于仪器昂贵，检测条件要求较高，不能得到广泛应用。高效液相色谱法是目前应用最广泛的农药残留检测方法，但大部分为单一农药或两种农药混合的报道，尚无同时测定多种农药残留的文献报道。【拟解决的关键问题】以香菇、红菇和平菇为研究材料，采用高效液相色谱仪对食用菌中的吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲农药多残留的检测方法进行研究，以建立一种操作简易、灵敏度高、重现性好的可同时测定食用菌中吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲残留量的高效液相色谱法，以期为我国食用菌的安全生产提供保障。 1材料与方法 1.1 试验材料 供试食用菌为香菇、红菇和平菇，均来自广东湛江农贸市场。供共农药：吡虫啉、啶虫脒、除虫脲、多菌灵标准品(纯度>95%)均来自上海安谱科学仪器有限公司。试验仪器： Waters 2695型高效液相色谱仪配有2695检测器、自动进样器、四元泵、真空在线脱气机、Empower工作站)、组织匀浆机、旋涡混合器、离心机、固相萃取装置、电子天平。试剂：超纯水，甲醇为色谱 纯，乙腈、氯化钠、氨水、二氯甲烷均为分析纯，氨基固相萃取小柱 500 mg/6mL)。 标准储备液的配制：分别称取0.01g的吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲标准品，用甲醇溶解于50.0 mL容量瓶中，于4℃下保存。 混合标准工作液的配制：准确量取适量标准储备液，用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作液。 1.2色谱条件 色谱柱：Symmetry Ci( 250 mmx4.6 mm，5 pm)；流动相：甲醇一水(体积比40：60)，用前经0.45 p.m滤膜过滤。柱温：35℃；流速：0.9 mL/min；进样量20.0pL；检测波长275 nm。 1.3试验方法 1.3.1 样品的提取 称取5.0g试样，加入25.0 mL乙腈，加5.0 g无水硫酸钠，超声波仪超声5 min，旋涡混合3 min，离心机10000 r/min离心7 min，将上清液转移至烧杯中。置于50℃水浴中中吹至近干，加入2.0mL甲醇+二氯甲烷体积比5：95，下同)溶解残渣，待净化。1.3.2 净化 将氨基柱用4.0mL甲醇+二氯甲烷预洗后立即加入上述待净化液，收集洗脱液，用2.0mL甲醇+二氯甲烷洗烧杯后过柱，重复一次，将收集的洗脱液置于50℃水浴中用氮气吹干，用2.0mL甲醇溶解残渣，旋涡混匀，0.45 pm滤膜过滤，待测。 2结果与分析 211提取溶剂的选择 吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲均属于弱极性物质，不易溶于水，易溶于二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷、甲醇、乙腈等有机溶剂。本研究比较了甲醇、三氯甲烷、丙酮和乙腈对食用菌中供试4种农药的提取效果，结果表明，乙腈和丙酮的提取效果较其他溶剂好，但丙酮易挥发，稳定性差，对吡虫啉和啶虫脒的提取效果稍差，而采用乙腈作为提取溶剂，不但能沉淀蛋白质，而且脂肪提取物和溶出杂质相对较少，有利于进一步净化；另外，乙腈提取的操作过程相对简单，提取效果也较好。乙睛提取吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲4种农药的回收率分别达106%、83%、93%和95%，提取效果能满足要求，因此以乙腈作为提取溶剂。 22固相萃取小柱的选择 固相萃取小柱是样品净化的关键，如果固相萃取小柱选择不当，样品净化效果不好，将严重影响待测物质测定的准确性。食用菌中含有大量的内源性杂质，基体成分较复杂，对供试4种农药的测定干扰严重。在净化过程中分别采用弗罗里硅土柱、氨基固相萃取柱、石墨碳NH，固相萃取柱对样品进行净化处理，结果发现使用石墨碳NH，固相萃取柱净化时对样品中 的色素吸附效果较好，但对啶虫脒的吸附性也很强，得到的回收率不理想；弗罗里硅土柱对农药的吸附能力较小，回收率较低；而氨基固相萃取柱可将全部净化液进行洗脱后用于检测，得到较低的检出限，回收效果较好，因此选择氨基柱对样品进行净化处理。 23洗脱溶剂的选择 用氨基柱对4种农药进行净化，若洗脱溶剂极性太弱，有些组分不易被洗脱；若极性太强，不必要的组分尤其是色素等会被洗脱，从而干扰测定结果。利用吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲在二氯甲烷和甲醇中均有很好的溶解性，采用5%甲醇+95%二氯甲烷混合液对4种农药进行洗脱，其操作简单，回收率高，能有效去除样品中的基质干扰，净化效果较好，因此选择5%甲醇+95%二氯甲烷混合液作为洗脱溶剂。 24检测波长的选择 用PDA检测器对供试4种农药进行三维扫描，结果发现，吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲在275 nm处均有较大吸收，且基线噪音小，色谱峰的信噪比更为理想，因此选择275 nm作为检测波长，以实现供试4种 农药的同时测定。 25流动相的选择 本研究分别对乙腈一水、甲醇—水两种流动相组成以及不同配比进行选择，结果表明，在甲醇一水的体积比为40：60色谱条件下，色谱分离效果最好，基线较平稳，噪音小，杂质峰与吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲的色谱峰能完全分开；用乙腈一水做流动相，目标峰也能较好地分离，但考虑到乙腈毒性较大，因而选择用甲醇一水做流动相。 26方法的线性范围和相关性 分别配制0.02、0.10、0.50、1.00、2.00、3.00 pg/mL系列质量浓度的混合标准工作溶液，按1.2的色谱条件进行分析，以各农药的质量浓度x)对其对应的色谱峰面积y)进行线性回归，得出4种药剂的标准曲线。结果表明，吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲在0.02~3.00 pg/mL范围内呈良好的线性关系，相关系数均在0.9990以上，根据3倍信噪比计各各组分的最低检出限。检出限较小，说明灵敏度高。线性回归方程、相关系数和检出限见表1。 Tab.1 Linear ranges， regression equation and detection limit 化合物 线性范围 pg/mL) 回归方程 相关系数 检出限(mg/kg) Compound Linear range Regression equation Correlation coefficient Detection limit 吡虫啉 Imidacloprid 0.02~3.00 v=1328.3x+168.2 0.9993 0.002 啶虫脒 Acetamiprid 0.02~3.00 y=1086.5x+205.3 0.9992 0.005 多菌灵Carbendazim 0.02~3.00 y=1538.2x+202.7 0.9995 0.005 除虫脲 Diflubenzuron 0.02~3.00 v=1328.3x+288.2 0.9996 0.006 27回收率和精密度 选择无杂质干扰的香菇、红菇和平菇作为空白样品，在空白样品中添加3个浓度水平(0.2、0.5和1.0mg/kg) 的吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲混合标准工作溶液，每个添加水平设3个平行样，按上述前处理和仪器条件进行回收率测定，计算平均加标回收率和相对标准偏差 RSD)。结果在3个添加水平范围内的平均回收率为83%~106%，RSD为0.5%~3.4%。供试4种农药的回收率均很高，相对标准偏差值很小，说明该方法具有很高的准确度和精密度。4种农药混合标准品的色谱图见图1，香菇样品及其添加回收色谱图见图2和图3。 3讨论 高效液相色谱法是目前应用最广泛的农药残留检测方法，但大部分文献为单一或两种农药混合的研究报道。本研究结果表明，乙腈作为提取溶剂比甲醇、三氯甲烷、丙酮等溶剂提取效果更好，与李慧冬等 图1 吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、除虫脲混合标液色谱图 Fig.1 Chromatogram of imidacloprid， acetamiprid， carbendaz-im and diflubenzuron mixed standard solution 1：比虫啉；2：啶虫脒；3：多菌灵；4：除虫脲 1：imidacloprid；2：acetamiprid；3：carbendazim；4：diflubenzuron (2006)、董爱军等(2010)研究的提取溶剂一致，但净化条件不一样，董爱军等(2010)在提取液中添加40mg的ODS和PSA进行净化，以去除样品中的杂质，但其检出限为0.03 mg/kg， 且该方法只能测定食用菌中的多菌灵，不能测定其他组分，比较单一。本研究采用氨基固相萃取柱进行样品净化去除杂质，检出限小于 图2 香菇空白样品色谱图 Fig.2Chromatogram of blank sample of Lentinus edodes 图3 香菇加标样品色谱图 Fig.3 Chromatogram of added sample of Lentinus edodes 1：吡虫啉；2：啶虫脒；3：多菌灵；4：除虫脲 1：imidacloprid；2：acetamiprid；3：carbendazim；4： diflubenzuron 0.007 mg/kg，且能同时测定4种组分，说明该方法灵敏度更高，方法更可靠。李慧冬等(2006)采用弗罗里硅土小柱进行净化，用的是气相色谱法，但只能测定甘蓝中的啶虫脒，不能进行其他3种农药的测定。本研究发现使用氨基固相萃取柱净化比弗罗里硅柱和石墨碳NH，固相萃取柱的净化效果更好，回收率更高，与陈婷等(2012)研究所使用的净化柱相一致，但陈婷等(2012)是用超高效液相色谱法对食用菌中吡虫啉、啶虫脒和多菌灵3种农药残留进行测定，而本研究是通过对前处理、色谱条件的优化，以获得适用于食用菌中4种农药残留的检测方法。 4 结论 本研究通过提取条件、净化条件和色谱条件的优化，建立了检测食用菌中吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲的高效液相色谱法，即：以乙腈作为提取溶剂、氨基柱净化、高效液相色谱二极管检测器测定、外标法定量的方法。该方法能获得较好的灵敏度、精密度和准确度，具有操作简易、快速、适用性强的特点，适用于食用菌中吡虫啉、啶虫脒、多菌灵和除虫脲的测定。 ( 参考文献 ： ) ( 陈 婷，黄利 英 ， 邱 城，刘青海，高涵莹.2 012 .超高效液相色谱法对食用菌中3 种 农药残留量的测定J ] .现 代 农业科 技 ( 1 3 )： 1 24-1 26 . ) ( C h e n T ， H uang L Y， Q iu C， L iu Q H， G a o H Y. 2 012. 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