玉米、小麦中赭曲霉毒素A检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2020-F004 解决方案 玉米、小麦中赭曲霉毒素A的测定 全自动固相萃取；高效液相色谱法；赭曲霉毒素A 介绍 赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。：。它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素。其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品污染最严重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A。 采用Raykol Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪分析食品中的赭曲霉毒素A，试样经过60%乙腈水提取，提取液经离心、稀释后用含有赭曲霉毒素A特异抗体的免疫亲和柱自动净化。用10 mL真菌毒素清洗缓冲液和10mL水淋洗柱子将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和柱。将洗脱液在45℃条件下氮吹干，用0.5mL初始流动相定容，经高效液相色谱仪上机分析。 图-1.八种糖皮质激素的结构式 本文参考GB 5009.96-2016《食品中赭曲霉毒素A的测定》第一法，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱检测，建立了复杂粮油样品基质中赭曲霉毒素A高灵敏度的前处理和分析方法，得到常见粮油样品中赭曲霉毒素A的加标回收率在92-102%之间，RSD值小于5%。 1.仪器、耗材 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 赭曲霉毒素A免疫亲和柱(Romer，60 mg/3mL) 高效液相色谱： Waters ACQUITY UPLC I-Class配备大体积流通池 甲醇 (Merck，色谱纯) 乙腈 (Merck，色谱纯) 2.标准曲线配置 使用睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站可实现标准品的全自动化配置，可将购买的单标母液(100mg/L)通过工作站的直接稀释模式，配置成浓度为1 mg/L 的工作中间液，紧接着可通过程序设置，吸取该工作液，配置一条浓度分别为1.0 ug/L， 2.0 ug/L， 10 ug/L， 50 ug/L 和 100 ug/L 3.样品提取与前处理 玉米样品前处理 准确称取5g玉米样品于50 mL 离心管中，加入 20 mL 60%乙腈水溶液，涡旋震荡提取 20 min，以7000 r/min 的转速离心5min， 取4mL上清液 小麦样品前处理 准确称取5g小麦样品于50 mL离心管中，加入 20 mL 60%乙腈水溶液，涡旋震荡提取 20 min，以7000 r/min 的转速离心5 min， 取4mL上清液 固相萃取净化条件 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 赭曲霉毒素A免疫亲和柱(Romer，60 mg/3 mL) 淋洗 真菌毒素清洗缓冲液和超纯水 洗脱 甲醇 吐温-20 (Sigma， 试剂纯) PBS 盐包 氯化钠 碳酸氢钠 冰乙酸 超纯水 (Waston) 真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中，加入 0.1mL 吐温-20，用水稀释至1L。 的标准工作曲线。 图-2. Auto Prep 200 液体工作站配标程序 于80 mL玻璃上样管中，加入26 mL PBS缓冲液稀 释混匀，待用。于80mL 玻璃上样管中，加入26mL PBS 缓冲液稀释混匀，待用。 以2 mL/min 的速度精确上样30 mL 待测液，用10mL真菌毒素清洗缓冲液和 10 mL 水淋洗免疫亲和柱，气推30mL 吹干免疫亲和柱，推速为80mL/min。最后用2mL甲醇以0.5 mL/min 的速度洗脱样品，收集洗脱液用睿科 AutoEVA-60 全自动平 行浓缩仪于45°C、2 psi 条件下氮吹干，用初始流动相定容至0.5mL，过滤膜上机分析。详细步骤见图-3。 图-3. Fotector Plus 赭曲霉毒素A免疫亲和净化方法 4.检测条件 表-2赭曲霉毒素A液相色谱检测条件 色谱柱 Waters BEH-C18 (2.1×100 mm， 1.7 um) 流速 0.200 mL/min 流动相 乙腈：水：冰乙酸=96：102：2 柱温 35 进样体积 10pL 梯度洗脱 等度洗脱 荧光检测器 激发波长333nm 发射波长460nm 5.样品测试 玉米样品加标测试 取玉米样品 5g， 添加1 ug/kg 的赭曲霉毒素A 如下表-3所示：标准品，进行上述步骤的前处理净化，样品回收率 表-3添加水平为1 ug/kg 玉米样品回收率 名称 回收率 平均回收率 RSD 1 2 3 4 5 6 OTA 95.7% 95.6% 92.5% 98.7% 97.3% 100.4% 96.7% 2.8% 小麦样品加标测试 小麦样品中添加水平为1 ug/kg 的赭曲霉毒素 A回收率结果： 表-4添加水平为1 ug/kg 小麦样品回收率 名称 回收率 平均回收率 RSD 1 2 3 4 5 6 OTA 97.2% 92.7% 94.8% 101.2% 99.7% 96.7% 97.0% 3.2% 6.结果与讨论 淋洗柱子对回收率的影响 淋洗溶剂对回收率的有一定影响，应以10 mL真菌毒素清洗缓冲液和10 mL 纯水除去免疫亲和柱 上残留的色素和基质。若不用真菌毒素清洗缓冲液淋洗而只是用水淋洗，6个样品的平行性降低， RSD值大于10%。 洗脱速度的影响 采用1mL/min 的洗脱速度，洗脱效果不佳，回收率在80%以下；降低洗脱速度至 0.5 mL/min， 7.注意事项 提取液与 PBS 缓冲液稀释混匀后若比较浑浊，可以再次高速离心方便后续过免疫亲和柱。 谷物中离心完成后，不可放置过长时间，否则 8.总结 本文采用睿科 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪，结合 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪，优化建立玉米、小麦中赭曲霉毒素A的测定前处理方法。 采用 Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站可实现混标、标准曲线的自动配置，全程无需人为值守，让实验人员远离有毒有害的化学物质，保护身体健康。Fotector Plus 高通量全自动固相萃 洗脱效果有明显提升，回收率在 90-102%之间。因此洗脱速度不宜设置得过快。 谷物容易重新吸水，，可能导致提取液的浓度过高，使样品的回收率偏高，影响测试结果。 取仪对样品进行检测能同步进行6个样品净化，连续自动处理60个样品，做样通量高，提高了工作效率。AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪处理通量高，60个样品可同时进行氮吹，实验平行性好 本解决方案的准确性、重复性、再现性均满足实验要求，能够用于 GB 5009.96-2016《食品中赭曲霉毒素A的测定》方法对玉米和小麦样品的测定。 全自动液体样品处理工作站标液配制 高通量全自动固相萃取仪净化 全自动平行浓缩仪浓缩 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知 @睿科集团股份有限公司 2020年5月版 邮箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素。其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品污染最严重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A。采用Raykol Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪分析食品中的赭曲霉毒素A，试样经过60%乙腈水提取，提取液经离心、稀释后用含有赭曲霉毒素A特异抗体的免疫亲和柱自动净化。用10 mL真菌毒素清洗缓冲液和10 mL水淋洗柱子将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和柱。将洗脱液在45 ℃条件下氮吹干，用0.5 mL 初始流动相定容，经高效液相色谱仪上机分析。本文参考GB 5009.96-2016《食品中赭曲霉毒素A的测定》第一法，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱检测，建立了复杂粮油样品基质中赭曲霉毒素A高灵敏度的前处理和分析方法，得到常见粮油样品中赭曲霉毒素A的加标回收率在92-102%之间，RSD值小于5%。