多肽中分离组学检测方案(液相色谱仪)

上海通微分析技术有限公司Unimicro (Shanghai) Technologies Co.， Ltd. Halo Bioclass Peptide 系列多肽分离专用柱-助力组学分析 1.背景介绍 Halo 新型核壳填料色谱柱技术：Halo 色谱柱采用创新性熔融核技术制备色谱柱填料，把全多孔硅胶层熔合在实心球型硅胶材料上制备而得，采用该技术制备的填料也被称作表面多孔颗粒以及核壳型色谱填料，独特的核壳结构(实心球体外面包裹个几十个纳米的壳层有效固定相)使得制备出的 UPLC 与 HPLC 色谱柱具有超快速分离、高分离度、高柱效等特点。 核壳结构填料的切面电镜照片 除常规小分子样品分析外， Halo 色谱柱针对生物大分子样品的分离(如多肽、蛋白、聚糖)，推出 Halo BioClass 系列专用柱，其中有针对多肽分离的 Peptide 专用柱，有针对蛋白分离的 Protein 专用柱，也有针对聚糖分离的 Glycan 专用柱。其中，适于多肽分离的 Halo BioClass Peptide 系列色谱柱，.1可有效实现20kDa 分子量以下的多肽的快速分离，获得高的分离度和峰容量。 选型指导 待测样品分子量范围 孔径A 应用领域 粒径 所属类型 小分子(<5000Da) 90 小分子 2，2.7，5 HALO 小分子(<20kDa) 90 糖 2.7 HALO BIOCLASS 中等大小分子(100Da50kDa) 1000 2.7 Halo BioClass Peptide 可提供 2um， 2.7um， 5um 等不同粒径的填料，适用于 UPLC，HPLC， LC-MS 等多种系统。填料类型有适于多肽分离的 Halo Peptide ES-C18， HaloPeptide ES-CN 以及 Peptide Phenyl-Hexyl等多种填料，可满足大部分的多肽分离。 键合相 对 应USP 粒径um 孔径A 含碳量(%) 比表面积(m²/g) 适用pH下限及温度下限 适用 pH上限及温度上限 是否封尾 waoa ES-C18 Ll 2 2.75 160 4.04.64.0 65 9060 1/90°C 8/40 °C 否 ES-CN L10 2.75 160 2.21.5 9060 1/90°C 8/40°C 是 Phenyl-Hexyl L11 2.7 160 4.7 90 2/90°C 9/40°C 是 Halo Peptide ES-C18 固定相是将十八烷基键合在孔径为160A 的熔融核材料上，特殊的设计使其能够超快速、高分辨率分离分子量高达 20 kDa 的肽类物质。Peptide ES-C18柱的分离机理主要基于疏水作用，适用于分子量<20kDa 的蛋白和多肽的分离。选择160A孔径是为了保证多肽能从固定相孔通道里通过，同时维持被分析物-固定相-流动相相互作用界面足够的比表面积。此外，由于键合相受空间位阻保护，使得 PeptideES-C18 柱在低 pH 值、高温条件下，反相色谱模式分离多肽稳定性更好。 Halo Peptide ES-CN 键合相对被分析物具有强的偶极力相互作用和较弱的疏水键合作用。ES-CN 是通用固定相，它常被运用于反相色谱分离，但也能作为HILIC 模式和正相色谱模式的固定相。由于 ES-CN柱的氰基基团受立体位阻保护，因而与常规 CN 柱相比稳定性更好。此外， ES-CN 柱随流动相变变的快速平衡能力与低渗出率使其特别适合运用于高通量 LC-MS分析。适用于分子量<20kDa 的蛋白和多肽的分离。 Peptide Phenyl-Hexyl 苯基己基键合固定相的分离机理主要包括-元键作用，偶极相互作用于中等强度疏水作用。苯基己基柱可用于分离具有元键或偶极矩不同的混合分析物，例如取代基芳香族化合物，立体对映体，类固醇等。由于苯基己基固定相的疏水极性，因此该柱允许使用高水比例的流动相。适用于分子量<20kDa 的蛋白和多肽的分离。 2.应用实例 1) HALO-2.7 Peptide ES-C18 色谱柱分离肽类及小分子蛋白 测试条件： 色谱柱： Halo-2.7 PeptideES-C18， 4.6×50mm货号：92124-402 流动相： A=90%(0.1%TFA 水溶液)/10%乙腈， B=30%(0.1%TFA 水溶液)/70%乙腈，梯度：0%B相to 87%B 相 in 1.0min 流速：5.0mL/min压力：330 Bar温度：60℃检测器： UV 220 nm进样量： 1.0 puL 样品溶剂：流动相A HALO-2.7 Peptide ES-C18色谱柱分离肽类及小分子蛋白 样品峰：1. Gly-Tyr， 2. Val-Tyr-Val， 3. 血管紧张素(-1-7)胺，4.甲硫氨酸脑啡肽 Met-Enk， 5. 血管紧张素(-1-8)胺，6.血管紧张素Ⅱ，7.亮氨酸脑啡肽 Leu-Enk，8.核糖核酸酶 A， 9.血管紧张素(-1-12)(人)，10.血管紧张素(-1-12) (鼠) √ Halo Peptide ES-C18孔径为160A，适用于多肽和小分子蛋白(20kDa以内) 的分离，提高了低 pH 和高温稳定性，普遍应用于生物样品分离。 2) HALO-2 Peptide ES-C18 色谱柱分离蛋白 测试条件： 色谱柱：2.1x150 mm HALO-2 Peptide ES-C18货号：91122-702 流动相： A=(0.1%三氟乙酸)水，B=(0.1%三氟乙酸)80/20乙腈/水，梯度：55'%——50% B in 90 min流速：0.5mL/min 压力：577 Bar 温度：60℃ 检测器： UV215nm 进样量： 0.5 uL 样品溶剂：流动相A G0121 Peak capacity： 584 HALO-2Peptide ES-C18 色谱柱分离蛋白 样品峰：1.Asp-Phe (MW=280)，2. Tyr-Tyr (MW=580)，3.血管紧张素(-1-7)胺(MW=898)， 4. 血管紧张素Ⅱ(MW=1046)，5.血管紧张素(-1-12(人)(MW1509)，6.神经降压素(MW=1673)， 7.β-脑内啡(MW=3465)，8.蛙皮降压肽(MW=4599)，9.二甲基胍(MW=2847) 3) Halo Peptide Phenyl-Hexyl 色谱柱大大改善胰蛋白酶片段的分离效果 测试条件： 色谱柱： HALO 160A ES-CN， 2.7 um， 2.1 x 100 mm货号：92122-604 HALO160A Phenyl-Hexyl， 2.7 um， 2.1 x100 mm， Part Number： 92112-606 HALO 160A ES-C18， 2.7 um， 2.1x 100 mm， Part Number： 92122-602 流动相： A=(10mM二氟乙酸)水， B=(10mM二氟乙酸)乙腈，梯度：2%-50%B in 60 min 流速：0.3 mL/min 温度：60℃ 检测器： UV220nm 进样量：5pL 0.2mg/mL 的样品 样品溶剂：50mM Tris-HCl缓冲液/1.5M盐酸胍，含0.25%甲酸 样品峰： 1.FTISADTSKNTAYLQMNSLR (754 m/z)，2. LScAASGFNIKDTYIHWVR (747 m/z)， 3.GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK， 4. LLIYSASFLYSGVPSR (592 m/z)， 5. SGTASVVcLLNNFYPR (899m/z)， 6. ScDKTHTcPPePAPELLGGPSVFLFPPKPK (834 m/z)， 7.VVSVLTVLHQDWLNGKEYK (1115m/z) 4)相比传统全多孔填料，Halo Peptide 色谱柱具有更高的柱效和峰容量 测试条件： 色谱： HALO 160 A ES-C18， 2.7 um， 4.6x 100 mm货号：92124-602 常规 C18， 3 um， 4.6x100 mm 流动相： A=90%水/10%乙腈/0.1%TFA， B=30%水/70%乙腈/0.1%TFA， 梯度：L：0%87.5%B in 2 min流速：2.5mL/min 温度：60℃ 进样量：5uL 注：图图上每个色谱峰均标识出了其半峰宽。 5) Halo Peptide ES-CN分离10种多肽和小分子蛋白有时具有更好的选择性 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-CN， 5 um 货号： ES-CN： 95124-704 HALO 160 A ES-C18， 5 um 货号： ES-C18：95124-702 流动相： A：水(0.1%TFA)，B=乙腈(0.1%TFA)，梯度：5%—50%B in 30 min 流速：1.0mL/min 温度：40℃ 测器：UV215nm Time (min.) 样品峰：1.天门冬氨酸-苯丙氨酸，2.血管紧张素(1-7)酒胺，3.酪氨酸-酪氨酸-酪氨酸，4.缓激肽，5.正亮氨酸脑啡肽，6.血管紧张素Ⅱ，7.神经降压素，8.β-内啡肽，9.蛙皮降压肽，10.蜂毒肽 √ 对于一些特殊的多肽和小分子蛋白， Halo Peptide ES-CN柱具有更好的选择性和分离度。 6) Halo Peptide ES-C18 和 Peptide ES-CN分离7种多肽和小分子蛋白 测试条件： 色谱柱： HALO160 A ES-C18，5 um， 4.6x150 mm货号：92124-702 HALO 160 AES-CN， 5 um， 4.6x150 mm货号：92124-704 流动相： A：水(0.1%TFA)， B=乙腈(0.1%TFA)，梯度：5%—50%B in 30 min 流速：1.0mL/min温度：40℃检测器：UV215 nm进样量： 10 uL样品溶剂：流动相A 样品峰：1.天门冬氨酸-苯丙氨酸，2.血管紧张素(1-7)酰胺，3.酪氨酸-酪氨酸-酪氨酸，4.缓激肽，5.亮氨酸脑啡肽，6.血管紧张素II， 7.神经降压肽 √ Halo 5pm，1， 160A孔径多肽专用柱适于分离 20kDa 分分量以下的小分子多肽和蛋白。 Peptide ES-C18 和 Peptide ES-CN 均可用于小分子多肽和蛋白的分离，二者对相同的多肽和蛋白样品具有不同的选择性。 7)多根(3根)Halo Peptide 色谱柱串联可获得很高的峰容量 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-C18， 2.7 um， 2.1 x 150 mm (3)货号：92122-702 流动相： A： 20mM甲酸铵水溶液(0.1%甲酸)，B：流动相A：乙腈=20：80，梯度： 5%55% B in 150min 流速：0.5mL/min 温度：70℃ 检测器： UV 220nm 进样量：50pL (25ug糖蛋白和脱铁运铁蛋白酶解液) √ 3根 Halo Peptide 160 A ES-C18， 2.7um 150mm色谱柱串联(总长450mm)， 获得了560个峰的峰容量。 8)相比传统全多孔 C18， Halo Peptide 160 A ES-C18在较低反压下，可获得好的分离效果 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-C18， 5 um， 4.6x150mm 货号：95124-702 100 A totally porous C18， 3.0 um， 4.6x 150 mm 流动相：A：水(0.1%TFA)， B：乙腈(0.1%TFA)，梯度：：28%—55%B in 5 min 流速：1.5mL/min 温度：60℃ 测器：UV 280nm 进样量： 15pL 样品溶剂：流动相A 反压：95 bar(HALO) 170 bar (传统全多孔柱) 样品峰：1.核糖核酸酶 A(13.7 kDa)， 2.细胞色素C (12.4 KDa)， 3.溶解酵(14.3 KDa)， 4. α-乳清蛋白(14.2KDa) √ 相比传统全多孔型色谱柱， Halo ES-C18 柱可以采用更大粒径填料，在较低反压下获得好的分离效果。 9)针对不同分子量的多肽和蛋白，选择合适孔径填料的色谱柱对于改善峰型获得好的分离效果非常重要 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-C18， 2.7 um， 4.6x 100 mm 货号：92124-602 HALO400AES-C18，3.4 um， 4.6x 100 mm 货号：93414-602 流动相：A：水(0.1%TFA)，B： 乙乙(0.1%TFA)，梯度：23%—50%B in 15 min 流速：1.5mL/min 温度：60℃ 检测器： UV215nm 进样量： 5pL 样品溶剂：流动相A 样品峰： 1.Ribonuclease A (13.7 kDa)，2. Cytochrome C (12.4kDa)， 3. Lysozyme (14.3 kDa) 4. a-Lactalbumin(14.2 kDa)， 5. Catalase (tetramer of~60 kDa each)，6. Enolase (46.7kDa) 对于大分子蛋白的分析，选择与其分子量匹配的大孔径填料色谱柱会获得更窄的峰型，更佳的检测效果，因为与大分子量匹配的大孔径，大分子的传质不会受阻碍。 10) Halo Peptide ES-18可获得高的峰容量 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-C18， 2.0 um， 2.1 x 150 mm货号：91122-702 流动相：A：水(0.1%TFA)，B：乙/水=80/20 (0.1%TFA)，梯度：5%-50% B in 90min 流速： 0.5mL/min 温度：60℃ 检测器：UV215nm 进样量： 0.5uL 样品溶剂：流动相A 样品峰：1.Asp-Phe (280)， 2. Tyr-Tyr-Tyr (508)， 3. Angiotensin (1-7) amide (898)， 4. Angiotensin II (1046)，5.Angiotensin (1-12) human (1509)， 6.Neurotensin (1673)， 7. B-endorphin (3465)，8. Sauvagine (4599)， 9. Mellitin(2847) √采用 HALO@ 2.0 um 160 A ES-C18色谱柱，可获得尖锐的窄峰，一定时间内(如90min)可获得很高的峰容量，特别适用于复杂样品的分析。 11) Halo Peptide ES-18 可获得高的峰容量 测试条件 色谱柱： HALO 160 A ES-C18， 2.0 um， 2.1x 100mm货号：91122-602 流动相：A：水(0.1%TFA)， B：乙腈/水=80/20(0.1%TFA)，梯度：：6%--54% B in 10min流速： 0.5mL/min 温度：60℃ 检测器： UV215nm 进样量：0.5uL 样品溶剂：流动相A 样品峰： 1. Gly-Tyr (238)2. Val-Tyr-Val (380)， 3. Met-enkephalin (574)， 4. Angiotensin ⅡI (1046)， 5.Leu-enkephalin (556)，6. Ribonuclease A (13，700)，7. Bovine insulin (5733) √ Halo Peptide ES-C18 色谱柱在可以耐受低 pH 值的酸性流动相以及高柱温条件使用，重复进样480针后仍能获得良好的定性定量重复性结果。 12) Halo Peptide ES-18 具有良好的批次重现性 测试条件： 色谱柱： HALO160 A ES-C18， 2.0 um， 3.0 x 50 mm 货号：91123-402 流动相：A：水(0.1%TFA)， B：乙腈/水=80/20(0.1%TFA)，梯度： 0-0.1min 12.5%B； 0.1-2.0 min 12.5%B-93% B 流速：1.1mL/min 温度：60℃ 检测器： UV215nm 进样量：0.5uL 样品溶剂：流动相A Time， min 样品峰 MW %RSD (保留时间) 1. Gly-Tyr 238 1.21 2. Val-Tyr-Val 380 1.59 3. Angiotensin 1/2 (1-7) amide 898 0.95 4.Met-enkephalin 574 0.92 5. Angiotensin 1/2 (1-8) amide 1045 0.60 6. AngiotensinII 1046 0.61 7. Leu-enkephalin 556 0.82 8.Ribonuclease A 13.700 0.35 9. Angiotensin(1-12)(mouse) 1573 0.46 10.BovineInsulin 5733 0.49 11.Angiotensin (1-12)(human) 1509 0.36 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-C18，2.7 um， 2.1x150 mm货号：92122-702 HALO 160 A ES-CN， 2.7 um， 2.1 x 150 mm货号：92122-704 HALO 160 A Phenyl-Hexyl， 2.7 um， 2.1 x150 mm货号：92112-706 流动相：：A：水(0.1%甲酸)+10mM甲酸铵溶液，B：正丙醇/水=50/50+0.1%甲酸+10mM甲酸铵， pH3.45 梯度：10-60%B；0-15 min 流速：0.4mL/min 温度：60 检测器： UV220nm 进样量：2.0pL 样品溶剂：水(0.1%TFA) 样品峰：1.Tyr-Tyr-Tyr，2. Angiotensin II， 3. Angiotensin 1-12， 4. Melittin， 5. Sauvagine， 6. B-Endorphin Halo 160 A ES-C18无法实现峰5和峰6的完全分离， Halo 160 A ES-CN 虽然可实现峰5和峰6的完全分离，但峰3和峰4出现了共洗脱现象， HALO 160 A Phenyl-Hexyl可以实现上述6种物质的完全分离。 14) LC-MS 配合 HALO 160 A Phenyl-Hexyl 色谱柱分离胰蛋白酶具有很好的选择性 测试条件： 色谱柱： HALO 160 A ES-CN， 2.7 um， 2.1x 100 mm货号：92122-604 HALO 160 A Phenyl-Hexyl， 2.7 um， 2.1 x 100 mm货号：92112-606 HALO 160 AES-C18， 2.7 umm 2.1 x 100 mm货号：92122-602 流动相： A：水+10mMDFA， B： 乙腈+10mM DFA，梯度：：22-50% B； 0-60min 流速：0.3mL/min 温度：60℃ 检测器： UV220nm(MS-MS) 进样量：5.0pL(0.2mg/mL)样品溶剂：50mM Tris-HCl/1.5 M Guanidine-HCl with 0.25% formic acid Time， min 样品峰：1.FTISADTSKNTAYLQMNSLR (754 m/z)，，22. LScAASGFNIKDTYIHWVR (747 m/z)， 3.GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK (849 m/z) 4. LLIYSASFLYSGVPSR (592 m/z)5SGTASVVcLLNNFYPR(899 m/z)，6. ScDKTHTcPPcPAPELLGGPSVFLFPPKPKK(834m/z)，，7VVSVLTVLHQDWLNGKEYK (1115 m/z) √ The HALO 160 A Phenyl-Hexyl 对于一些特殊样品(如胰蛋白酶)的分析检测具有更好的选择性。 UV 220 nm traces HALO 160AES-CN EIC signals normalized O W- MS System： Thermo Fisher Orbitrap VelosPro ETD ESI：+3.5kV Scan Range： 50-2000 m/z Scan Rate： 2 pps Capillary： 225 C Sheath Gas：35 Auxiliary Gas： 10 Scan Time： 2 pscans/200 ms max inject time 15)柱长对分离的影响-HALO 160 A ES-C18分离脱铁转铁蛋白胰蛋白消化酶 测试条件： 色谱柱： HALO 160AES-C18， 2.7 um， 2.1x 100 mm，货号：92122-602 HALO160 AES-C18，2.7 um， 2.1x150 mm货号：92122-702 流动相：A：水(0.1%TFA)， B： 乙腈/水=80/20(0.1%)， Gradient A： 5-60% B；0-60 min； Gradient B： 5-60%B； 0-180 min； Gradient C： 5-60%B；0-270 min； 流速： 0.4mL/min 温度：60℃ 检测器： UV215nm 进样羊：10pL) 样品溶剂：水 √ 上图对比了采用3种不同长度(分别是：1根2.1x 100 mm，2根2.1x150 mm串联，3根2.1x150 mm串联) HALOQ 160 AES-C18柱分离脱铁转铁蛋白胰蛋白消化酶的效果：采用长柱并适当延长梯度时间可有效改善分离效果，柱长延长3倍-4.5倍使得分离度也提高了约 70%-110%。 16)HALO 160 A ES-C18分离脱铁转铁蛋白胰蛋白消化酶 测试条件： 色谱谱：两根 HALO 160A ES-C18， 2.7 um串联， 2.1x100mm货号：92122-602 流动相：A：水(0.1%TFA)， B：乙腈/水=80/20(0.1%)，梯度：5-60%B； 0-120 min； 流速：0.5mL/min 温度：60℃ 检测器：UV215nm 进样量：35uL) 样品溶剂：流动相A √ 两根2.7 um HALO 160 A ES-C18 串联可在 90min 内实现脱铁转铁蛋白胰蛋白消化酶的高效分离，大大增加峰容量； ES-C18 在高柱温下分离，可有效改善峰型和分离度，而且特殊的空间位阻保护的官能团大大延长了色谱柱的使用寿命。 17) HALO 160 AES-C18， 2.0 um可在高流速下快速分离多肽和小分子蛋白 测试条件： 色谱柱： HALO 160 AES-C18， 2.0 um， 3.0x50 mm，货号：91123-402 流动相：A：水(0.1%TFA)， B：乙腈/水=80/20(0.1%)，梯度： 0-0.1min，12.5%B， 0.1-1.0min， 12.5%-63%B流速：2.2mL/min 温度：60℃ 检测器： UV215nm 进样量：0.5uL 样品溶剂：流动相A 样品峰 MW 1. Gly-Tyr 238 2. Val-Tyr-Val 380 3. Angiotensin 1/2 (1-7) amide 898 4. Met-enkephalin 574 5. Angiotensin 1/2 (1-8) amide 1045 6. Angiotensin II 1046 7. Leu-enkephalin 556 8.Ribonuclease A 13，700 9. Angiotensin (1-12) (mouse) 1573 10. Bovine insulin 5733 11. Angiotensin(1-12) (human) 1509 √ 使用 HALO 160 AES-C18， 可适当提高流速，来获得多肽和小分子蛋白的超快速分离。 www.unimicrotech.com.cn TEL：E-mail：info@unimicrotech.comcn Halo 新型核壳填料色谱柱技术：Halo色谱柱采用创新性熔融核技术制备色谱柱填料，把全多孔硅胶层熔合在实心球型硅胶材料上制备而得，采用该技术制备的填料也被称作表面多孔颗粒以及核壳型色谱填料，独特的核壳结构（实心球体外面包裹个几十个纳米的壳层有效固定相）使得制备出的UPLC与HPLC色谱柱具有超快速分离、高分离度、高柱效等特点。