Sup35中应激条件下通过相变保护细胞检测方案(凝胶成像系统)

Sup35-GFP Sup35 相变液滴可相互融合 CNS前沿文献追踪-Sup35 在应激条件下通过相变保护细胞 这次分享的还是一篇关于相变的文章，上次分享的文章讲的是相变液滴可加速细胞内的生化反应，这次的是相变液滴在细胞应激时抑制生化反应以便从应激中走出来时恢复正常生理功能，具体内容如下： Fig. 2. Phase transitions of prion-like domains. RNA-binding proteins (RNA recognition motif depicted by purple circles) can reversibly coalesce into dynamic liquid dropletsthrough transient interactions in their prion-like domains (PrLDs depicted as purple lines). Droplet persistence over time， or mutations in PrLDs that introduce potent stericzippers， can drive further condensation of aged droplets into a less dynamic form that can give rise to solid fibrillar protein aggregates that accrue in neurodegenerativedisease. 肮蛋白样结构域(prion-like domains) 能够诱导蛋白发生相变，相变液滴进一步“硬化”会形成病理性的纤维状聚集[1]，但关于含 prion-like domains 蛋白的生理功能研究并不是很清楚，文章作者想研究这一块，他选中了蛋白 sup35[2] t (min) 供能切断后 sup35 聚集成点状，细胞停止生长，供能恢复后点状结构消失-这挺有意思，因为也有文献报导 sup35可形成不可逆的纤维状淀粉颗粒 Recovery from stationary phase Sup35 除了在能量剥夺的情况聚集成点，在对数期过后的生长静止期也会聚集成点 Sup35 形成纤维状淀粉颗粒是依赖分子伴侣 Hsp104的，但聚集成点、分散并不依赖 Hsp104 (GdmCl 为Hsp104 抑制剂) 看 sup35点的特性：和聚集成纤维状淀粉颗粒(PSI+)时并不同 t (hours) 文献报道切断功能后胞内会酸化，作者实测了一下处在静息期生长停止的细胞的胞内 pH，发现也出现了酸化 用酸化试剂 DNP 试了一下，胞内酸化也能引起 sup35 聚集成点，暗示 sup35 对于供能状态变化的感知来源于对 pH的感应 Pab1-mCherry Merge Sup35 点并不和 Pab1共定位(为什么要看一下和 Pab1 的空间关系?因为 Pab1 通过感应 pH变化发生相变已经有人做了，是一篇2017年的 Cell， 不把这个解释清楚怎么发这篇 Science) 为了研究 sup35 聚集成点的行为，作者把它纯化出来，在体外进行了实验，发现 pH降低能引起 sup35 发生相变，聚集成液滴 t (s) 用 FRAP 看一下液滴内分子的状态，是运动变化的，但液滴的“年龄”越大，分子运动的速度越慢，暗示液滴有固化的趋势 年龄大的液滴除了内部分子运动较慢外，液滴间融合的速率也变慢了 Gel-like condensate 冷冻电镜实际看到了 sup35 相变液滴形成胶状聚集体 高盐或 pH 升高后， sup35相变液滴会消失-和细胞内实验一致 对 sup35 蛋白结构域进行分析，发现M结构域负电荷氨基酸 D、E被突变后， sup35 体内外相变行为发生变化， pH复复后相变液滴不消失，暗示M结构域的作用是感应 pH变化 看其他结构域对相变的影响：缺失N、M结构域，只剩c结构域时相变不可逆； NM组合的突变体相变及恢复能力和野生型相当； MC组合的突变体相变能力弱 Sup35 (S. cerevisiae) Sup35 (S. pombe) 不同酵母上 sup35 尽管序列上存在差异，但不同结构域的电荷分布很相似 基于电荷分布推论别的酵母的 sup35 也能发生相变，实际看一下 别的酵母的 sup35 把体外实验再做一遍-横向拉伸自己文章的意义 N：M：C domain WT Sup35 的相变行为阐述清楚了，开始看相变和生理功能的关系，将野生型和缺失NM 结构域(相变关键结构域)的突变型c进行对比：平常的时候生长状态两者没差异，但当应激后(能量剥夺或pH变化)再恢复突变型c生长受限 突变型C相变液滴在恢复正常后无法消失 C D Sup35 的作用调节翻译终止，多核糖体图谱分析(ploysome profiling) 发现在能量剥夺后细胞内翻译活性降低，重新供能后翻译活性恢复-和 sup35 相变行为重合，暗示相变作用对蛋白翻译行为存在调节 相变液滴不能再溶解的突变型c无法在恢复功能后像野生型一样快速恢复蛋白翻译，暗示外界刺激下相变液滴形成行为是一种自我保护，在刺激消失后液滴溶解以恢复细胞正常功能 前面用的是突变型c看不可逆相变行为对酵母应激后恢复生长的影响，作者又用了另外一个模型看 sup35不可逆聚集集酵母生长的影响： PSI+代表的是 sup35形成的纤维状淀粉颗粒，可以看到，当细胞内存在不 溶性的 sup35颗粒时，酵母恢复生长的能力受限 最后来个模式图：野生型 sup35 在应激条件下形成可逆的相变液滴， “关闭”翻译。在从应激恢复后， 液滴重新溶解，恢复蛋白的正常翻译工作。而突变型由于不可逆的相变使得翻译无法恢复，使得酵母生长受到影响 Sup35 这类含 蛋白结构域(prion-like)的蛋白形成“固态”颗粒 PSI， 调节蛋白翻译的作用是已知， prion-like 蛋白相变的文章也有人做过，这意味着相关的技术路线都是通的，按部就班的做就行了。但不是所有人都能看到这些，很多人感受到的往往只是作者很神奇的选中了 sup35，然后和时下热点相变建立关联，做出了一篇 Science ! 其实一切都是简单的、朴素的，哪有什么“神仙皇帝”22 ( [1] March Z M， King O D ， Shorter J. Pr i on-like domains as epigenetic regulators，scaffolds for subcellular organization， and drivers of neurodegenerative disease[J].Brain Research， 2016. ) ( [2] FranzmannT M， Jahnel M， Po z niakovsky A ， et al. Phase sepa r ation of a yeast prionprotein promotes cellular fitness [J].Science， 2018. ) 想了解更多 CNS 级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流： qianle522568 Sup35这类含朊蛋白结构域（prion-like）的蛋白形成“固态”颗粒PSI，调节蛋白翻译的作用是已知，prion-like蛋白相变的文章也有人做过，这意味着相关的技术路线都是通的，按部就班的做就行了。但不是所有人都能看到这些，很多人感受到的往往只是作者很神奇的选中了sup35，然后和时下热点相变建立关联，做出了一篇Science！ 其实一切都是简单的、朴素的，哪有什么“神仙皇帝”……[1] March Z M , King O D , Shorter J . Prion-like domains as epigenetic regulators, scaffolds for subcellular organization, and drivers of neurodegenerative disease[J]. Brain Research, 2016.[2] Franzmann T M , Jahnel M , Pozniakovsky A , et al. Phase separation of a yeast prion protein promotes cellular fitness[J]. Science, 2018.