植物油、食品、土壤和半沉积物中苯并芘、抗氧化剂、挥发性有机物检测方案(凝胶色谱仪)

依利特三 前言1 第1章 凝胶净化系统介绍2 1.1 工作步骤2 1.2 仪器设备2 1.3 仪器特点2 第2章 植物油中苯并芘的测定3 2.1 试剂与前处理设备3 2.2 实验方法3 2.3 实验结果3 第3章 食品中抗氧化剂的测定4 3.1 试剂与前处理设备4 3.2 实验方法4 3.3 实验结果4 第4章 土壤和沉积物半挥发性有机物的测定5 4.1 试剂与前处理设备5 4.2 实验方法5 4.3 实验结果6 附录1凝胶净化系统涉及标准汇总 前言 凝胶色谱是以多孔凝胶为固定相，利用凝胶孔的空间尺寸效应，使不同大小的分子达到分离的一种色谱技术。按照流动相不同，可以将凝胶色谱分为以有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱(GPC)和以水溶液为流动相的凝胶过滤色谱。其中凝胶渗透色谱(GPC)运用较多。凝胶色谱常用于样品前处理中。 污染物较多的样品常常需要先使用凝胶净化系统进行净化，然后再使用高效液相色谱仪(HPLC)、气相色谱仪(GC)、或者是气质/液质联用仪 (GC-MS/HPLC-MS)进行分析；凝胶净化系统可以有针对性地排除干扰物，从而提高分析准确性，同时可保护分析系统。 凝胶渗透分离原理：在样品分离过程中，大于尺寸排阻极限的化合物将会不受阻碍，直接通过柱子；而在工作范围内的小的化合物将会被填料截留，随着溶剂的洗脱逐渐渗透过填料的孔，随后流出柱子，从而达到样品分离的目的。 依利特仪器针对环境、食品等行业需要对有害物质的样品进行前处理的述求，推出Elite GPC凝胶净化系统。并使用该系统对植物油中苯并芘、抗氧化剂样品进行了净化，实验表明此系统具有安全、可靠、灵敏度高、操作简便、节省有机溶剂等优点，满足各行业对样品进行凝胶净化前处理的需求。 表1 凝胶净化系统适用标准(部分) 序号 标准名称 1 GB 5009 32-2016食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定 2 GBT 5009.19-2008食品中有机氯农药多组分残留量的测定 HJ 834-2017土壤和沉积物半挥发性有机物的测定气相色谱-质谱法 4 HJ 950-2018固体废物多环芳烃的测定气相色谱-质谱法 5 GBT23376-2009茶叶中农药多残留测定(气质法) 6 GB/T 19650-2005动物组织中农药多残留分析 7 中国药典(2015版)第四部-农药残留量测定法-22种有机氯类农药残留量测定法 注：更多适用标准请参加附件1 第2章 植物油中苯并芘的测定 2.11试剂与前处理设备 表3 主要化学试剂、标准品清单 表4 主要样品前处理设备 序号 试剂 纯度 序号 名称 规格型号 备注 1 甲苯 色谱纯 1 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 流动相过滤， GM- 2 乙酸乙酯 色谱纯 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W 0.33A 3 正己烷 色谱纯 3 分析天平 精确到0.0001g 4 环己烷 色谱纯 4 超声清洗器 3L/6L，40/60KHz， 流动相脱气， 120W AS3120 5 苯并芘标准品 >99.0% 5 涡旋混合器 混合 实验过程中其中玻璃器皿还包括容量瓶(1mL、5mL、10mL、100mL)、250mL圆底烧瓶、移液枪(0~1000uL，0~5000uL)、移液枪枪头(1mL，5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、滤膜等。 标准溶液配制 苯并(a)芘标准储备液(100ug/mL)：准确称取苯并(a)芘1mg(精确到0.01mg)于10mL容量瓶中，用甲苯溶解，定容。避光保存在0℃~5℃的冰箱中，保存期1个月。苯并(a)芘标准中间液(1.0ug/mL)： 吸取0.10mL苯并(a)芘标准储备液(100ug/mL)，用乙腈定容到10mL。避光保存在0℃~5℃的冰箱中，保存期1个月。苯并(a)芘标准工作液：把苯并(a)芘标准中间液(1.0ug/mL)用乙腈稀释得到 20.0ng/mL 的校准曲线溶液，临用现配。 样品提取 称取0.4g(精确到0.001g)试样，加入5mL正己烷，旋涡混合0.5min，待净化。 样品净化步骤 1.按照样品净化色谱条件，先取20.0ng/mL的校准品5.0mL，按照样品净化条件进样，根据标准品出峰时间，确定样品馏分收集时间(一般收集标准品色谱峰起点时间-0.2min到落点时间+0.2min之间的馏分)。2.设置馏分收集器收集集域，取实验样品5.0mL，按照样品净化条件进样。 第3章 食品中抗氧化剂的测定 3.1 试剂与前处理设备 表5 主要化学试剂、标准品清单 二叔丁基-4-羟甲基苯酚 ≥98% 3.2实验方法 标准溶液配制 抗氧化剂标准物质混合储备液：准确准取0.1g(精确至0.1mg)固体抗氧化剂标准物质，用乙腈溶于100mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1000mg/L的标准混合储备液，0℃~4℃避光保存。 抗氧化剂混合标准使用液：移取适量体积的浓度为1000mg/L 的抗氧化剂标准物质混合储备液稀释至浓度为500mg/L 的混合标准使用液。 样品提取 油类：称取1g(精确至0.01g)试样(5.1)于 50mL 离心管中，加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋 1min， 静置 10min， 用 5mL 正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取 min，3000r/min 离心 5min，收集乙腈层于试管中，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待净化。同时做空白试验。 3.3 实验结果 测定抗氧化剂标准品， 500pg/mL 表6 主要样品前处理设备 序号 名称 规格型号 备注 1 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W 流动相过滤， 3 正己烷 分析纯 GM-0.33A 3 分析天平 色谱纯 精确到0.0001g 4 旋转蒸发仪 ≥98% 5 超声清洗器 3L/6L，40/60KHz， 流动相脱气， 7 没食子酸辛酯 120W AS3120 6 涡旋混合器 ≥98% 混合 9 没食子酸丙酯 ≥98% 10 去甲二氢愈创木酸 ≥98% 11 2，4，5-三羟基苯丁酮 ≥98% 12 叔丁基对苯二酚 ≥98% 样品制备 液体样品混合均匀，取有代表性试样，密封保存。 样品净化 1、按照样品净化色谱条件，先取500mg/L的校准品5.0mL，按照样品净化条件进样，根据标准品出峰时间，确定样品馏分收集时间(一般收集标准品色谱峰起点时间-0.2min到落点时间 +0.2min之间的馏分)。2、称取样品(5.1)10g(精确至0.01g)于100mL容量瓶中，以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度，作为母液；取5mL母液于10mL容量瓶中以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度，待净化。 ( 3、设置馏分收集器收集区域，取实验样品 5.0mL， 按照样品净化条件进行净化。收集流出液，40℃下旋转蒸发至干，加2mL乙腈定容，过0.22um有机系滤膜，供液相色谱测定。同时做空白试验。 ) 第4章 土壤和沉积物半挥发性有机物的测定 4.11试剂与前处理设备 表7 主要化学试剂、标准品清单 表8 主要样品前处理设备 序号 试剂 纯度 序号 名称 规格型号 备注 1 丙酮 农残级 1 溶剂过滤器 1000mL 流动相过滤 2 环己烷 色谱纯 流动相过滤， 3 二氯甲烷 农残级 2 隔膜真空泵 0.08MPa，160W GM-0.33A 4 玉米油 药用级 3 分析天平 精确到0.0001g 5 苯二甲酸二(2-二乙基 研发专用，百灵 3L/6L，40/60KHz 流动相脱气， 己基)酯 威 4 超声清洗器 .120W AS3120 6 甲氧滴滴涕 分析用标品 5 涡旋混合器 混合 7 花 99.8%标品 6 氮吹仪 干燥 8 硫 99.95%标品 7 索氏提取装置 样品提取 实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(1mL、5mL、10mL、100mL)、250mL圆底烧瓶、移液枪(0~1000pL，0~5000uL)、移液枪枪头(1mL，5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、滤膜等。 4.2实验方法 标准溶液配制 凝胶渗透色谱校准溶液：含有玉米油(25 mg/ml)、邻苯二甲酸二(2-二乙基己基)酯(1mg/ml)、甲氧滴滴涕(200 mg/L)、莊(20 mg/L)和硫(80 mg/L)的混合溶液。 半挥发性有机物标准贮备液： p=1000 mg/L~5000 mg/L，市售有证标准溶液。 半挥发性有机物标准中间液：p=200 ug/ml~500 ug/ml。用二氯甲烷-丙酮混合溶剂(体积比1：1)稀释半挥发性有机物标准贮备液。内标贮备液： p=5000mg/L。1，4-二氯苯-d4、萘-d8、-d10、菲-d10、-d12和花-d12，市售有证标准溶液。亦可选用其他性质相近的半挥发性有机物做内标。 内标中间液： p=200 ug/ml~500 ug/ml。用二氯甲烷-丙酮混合溶剂(体积比1：1)稀释配置内标贮备液，并混匀。 替代物贮备液： p=1000 mg/L~4000 mg/L。苯酚-d6、2-氟苯酚、2，4，6-三溴苯酚、硝基苯-d5、2-氟联苯、4'4-三联苯-d14等市售有证标准溶液。 干燥剂：优级纯及水硫酸钠(Na2SO4)或粒状硅藻土 250 um~150 um(60目~100目)。置于马弗炉中400℃烘烤4h， 冷却后装入磨口玻璃瓶中密封，于干燥器中保存。 样品准备 将样品放在搪瓷盘或不锈钢盘上，混匀，除去枝棒、叶片、石子等异物，按照HJ/T166进行四分法粗分。用于筛选污染物为目的的样品，应对新鲜样品进行处理。自然干燥不影响分析目的时，也可将样品自然干燥。新鲜土壤或沉积物样品可采用冷冻干燥和干燥剂方法干燥。如果土壤或或积物样品中水分含量较高(大于30%)，应先进行离心分离出水相，再进行干燥处理。 称取20g(精确到0.01g)的新鲜样品，加入一定量的干燥剂混匀、脱水并研磨成细小颗粒，充分拌匀直到散粒状，全部转移至提取容器中待用。 样品提取 a)索氏提取：将制备好的土壤或沉积物样品全部转移入索氏提取套筒，加入校准曲线中间点以上浓度的替代物中间液(二氯甲烷-丙酮体积比1：1混合溶剂稀释替代储备液到p=200 ug/ml~500 ug/ml)，小心置于索氏提取器回流管中，在圆底溶剂瓶中加入100 ml二氯甲烷-丙酮混合溶剂(体积比1：1)，提取16h~18h，回流速度控制在每小时4~6次。然后停止加热回流，取出圆底溶剂瓶，待浓缩。b)加压流体萃取：按照HJ783执行。 样品浓缩 在室温条件下，开启氮气至溶剂表面有气流波动(避免形成气涡)，用二氯甲烷多次洗涤条吹过程中已露出的浓缩器管壁。浓缩至约2ml，停止浓缩。加入约5ml 凝胶渗透色谱流动相，进行溶剂转换，再浓缩至约1ml，待净化。 样品净化步骤 当分析的目的是筛查全部半挥发性有机物时，应选用凝胶渗透色谱净化方法。 a)凝胶参透色谱柱的校准 按照仪器说明书对凝胶渗透色谱柱进行校准，凝胶渗透色谱校准溶液得到的色谱峰应满足以下条件：所有峰形均匀对称；玉米油和邻苯二甲酸二(2-二乙基己基)酯的色谱峰之间分辨率大于85%；邻苯二甲酸二(2-二乙基己基)酯和甲氧滴滴涕的色谱峰之间分辨率大于85%；甲氧滴滴涕和花的色谱峰之间分辨率大于85%；和硫的色谱峰不能重叠，基线分离大于90%。 b)确定收集时间半挥发性有机物的收集时间初步定在玉米油出峰之后至硫出峰之前，洗脱出以后，立即停止收集。然后用半挥发性有机物标准中间液进样形成标准物谱图，根据标准物质谱图进一步确定起始和停止收集时间，并测定其回收率。沸点较低的半挥发性有机物的回收率受浓缩等因素影响导致回收率下降，当大部分的目标物回收率均大于90%时，即可按此收集时间和仪器条件净化样品，否否需继续调整收集时间和其他条件。c)提取液净化 用凝胶渗透色谱流动相将样品浓缩液定容至凝胶渗透色谱仪定量环需要的体积，按照确定后的收集时间自动净化、收集流出液，待再次浓缩。 再浓缩及加内标 净化后的试液再次按照照吹浓缩或旋转蒸发浓缩的步骤进行浓缩、加入适量内标中间液，并定容至1.0ml， 混匀后转移至2ml样品瓶中，待测。 4.3实验结果 表9)凝胶净化分析谱图参数 序号 名称 保留时间(min) 分离度 HJ834-2017要求 1 玉米油 7.27 2 邻苯二甲酸二(2-二乙基己基)酯 9.91 1.14 ≥0.85 3 甲氧滴滴涕 11.76 0.87 ≥0.85 4 花 16.00 1.92 ≥0.85 5 硫 18.24 0.97 ≥0.90 由以上结果可知，使用依利特凝胶净化系统对土壤样品进行净化，校准溶液中各物质的出峰顺序及分离度均能满足 HJ834-2017《土壤和沉积物半挥发性有机物的测定》的要求。 附录1凝胶净化系统涉及标准汇总 序号 行业 标准号 标准名称 色谱柱规格 流动相 要求 收集 1 食品 GB/T 5009.19-2008 食品中有机氯农药多组分残留量的测定 长30cm，内径2.3-2.5cm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 7.5-15min 2 食品 GB 5009.32-2016 食品中9种抗氧化剂的测定 300×20mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 玉米油与抗氧化剂 的分离度>85% 7-17.5min 3 食品 GB/T 5009.161- 2003 动物性食品有机磷农药多组分残留 300×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 35-70mL 4 食品 GB/T5009.218-2008 水果和蔬菜中多种农药残留量的测定 700x25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 105-185mL 5 食品 GB/T5009.162-2008 动物性食品中有机氯农药和拟除虫菊酯农药 长30cm，内径2.3-2.5cm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 7.5-15min 多组分残留量的测定 6 7 8 食品 GB/T 5009.163-2003 动物性食品中氨基甲酸酯类农药多组分残留高效液相色谱测定 500×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 35-70mL 食品 GB/T 5009.146-2008 植物性食品中有机氯和拟除虫菊酯类农药多种残留量的测定 700x25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 105-185mL 食品 GB/T19650-2006 动物肌肉中478种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法 400×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 22-40min 9 食品 GB/T 23816-2009 大豆中三嗪类除草剂残留量的测定 700×25mm 二氯甲烷 14-24min 10 食品 DB37/T 3406-2018 水产品中三嗪类、酰胺类、二硝基苯胺类除草剂残留量的测定气相色谱-质谱法 长30cm，内径2.3-2.5cm 乙酸乙乙/环己烷=1/1 8-23min 11 食品 SN/T2430-2010 进出口食品中罗丹明B的检测方法 400×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 9-19min 12 食品 GB/T2795-2008 冻兔肉中有机氯及拟除虫菊酯类农药残留的 200x25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 7.5-15min 测定方法气相色谱/质谱法 13 食品 GB/T 20772-2008 动物肌肉中461种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法 400×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 22-40min 14 食品 GB23376-2009 茶叶中农药多残留测定 320×25mm 乙酸乙酯/环不烷=1/1 18-28min 15 食品 GB 23200.86-2016 食品安全国家标准乳及乳制品中多种有机氯农药残留量的测定气相色谱-质谱/质谱 食品安全国家标准食品中地乐酚残留量的 400×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 10-22min 16 食品 GB 23200.23-2016 200×22mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 10.5-15min 测定液相色谱-质谱/质谱法 食品安全国家标准食品中氟烯草酸残留量 17 食品 GB 23200.62-2016 400×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 9.5-14min 的测定气相色谱-质谱法 食品安全国家标准食品中苄螨醚残留量的 7.5- 18 食品 GB 23200.77-2016 300×10mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 检测方法 12.5min 19 食品安全国家标准食品中有机磷农药残留食品 GB 23200.93-2016 700×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 23-31min量的测定气相色谱-质谱法 食品安全国家标准动物源性食品中9种有机 20 食品 GB 23200.91-2016 400x25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 100-165mL 磷农药残留量的测定气相色谱法 婴幼儿配方乳粉中 α-乳白蛋白的测定凝胶 TSK-GEL G3000SWXL 21 食品 DBS32 011-2016 色谱法 (7.8mmx300 mm) 22 食品 GB 5009.82-2016 食品中维生素A/D/E的测定 硅胶色谱柱 5pm 环己烷/正己烷=1/1 4.6×250mm 23 食品 GB 14750-2010 食品添加剂维生素A的测定 C18色谱柱 5um 4.6×150mm 甲醇-乙腈-水 24 环境 HJ912-2017 固体废物有机氯农药的测定气相色谱-质谱 硫之前到 玉米油、邻苯二甲 法 花之后 硫之前到 酸二(2-二乙基己 25 环境 HJ950-2018 固体废物多环芳烃的测定气相色谱-质谱法 基)酯、甲氧滴滴 花之后 硫之前到 26 环境 HJ834-2017 土壤和沉积物中半挥发性有机物的测定 涕、花的色谱峰之 花之后 间分辨率均大于 27 环境 HJ805-2016 土壤和沉积物多环芳烃的测定气相色谱- 质谱法 硫之前到 花之后 85%；菲和硫的色 28 环境 HJ891-2017 固体废物多氯联苯的测定气相色谱-质谱 600×25mm 硫之前到 谱峰不能重叠，基 法(发布稿) 花之后 线分离大于90% 29 环境 HJ951-2018 固体废物半挥发性有机物的测定气相色谱 -质谱法 硫之前到 菲之后 30 环境 HJ 963-2018 固体废物有机磷类和拟除虫菊酯类等47种 农药的测定气相色谱-质谱法 二氯甲烷 31 环境 HJ1023-2019 土壤和沉积物有机磷类和拟除虫菊酯类等 47种农药的测定气相色谱-质普法 二氯甲烷 32 环境 DB34/T 3304-2018 中草药中16种多环芳烃的测定气相色谱质 谱法 乙酸乙酯/环己烷=1/1 26-51min 33 环境 药典(2015)第四部 农药残留量测定法-22种有机氯类农药残留量测定法 400×25mm 乙酸乙酯/环己烷=1/1 18-30min 34 环境 药典(2015)第四部 维生素D的测定 硅胶色谱柱 5um 环己烷/正己烷=1/1 4.6×250mm 注：1、色谱柱规格型格栏中未特殊标注色谱柱填料类型的默认为 Bio-beads S-X3 填料； 2、空白表示相应标准中未明确规定对应内容。 大连公司 公司地址：高新园区七贤岭学子街2-2号 公司电话：0411-84753333(总机)-转销售部 公司传真：0411-84732323 客服电话：400-66-35483 公司网址： http：//www.eliteHPLC.com 苏州公司 苏州工业园区金鸡湖大道99号苏州纳米城西北区14栋501 电话：0512-67997572 北京办事处 地址：北京市朝阳区汤立路201号东亚奥北中心南区4号楼2单元2307室 电话：13624984285 济南办事处 地址：山东省济南市历下区奥体西路1222号力高国际10楼1-1816室 电话：18842689516 上海办事处 地址：徐汇区梅陇路130号华东理工大学实验四楼204室 电话：15140566435 武汉办事处 地址：武汉市洪山区鸿桂苑东区1栋1单元2501 电话：18842683216 南京办事处 地址：江苏省南京市建邺区集庆门大街218号万达西地8幢三单元408室 电话：18842682679 厦门办事处 地址：厦门市集美区鱼福三里383号127单元 电话：18842685196 西安办事处 地址：陕西省西安市西稍门十字西南角柠檬宫舍11505室 电话：18842681836 广州办事处 地址：广州市白云区东兴二街3号擎山苑C2栋1404房 电话：18842683616 成都办事处 地址：成都武侯区九兴大道6号高发大厦A座610 电话：18842681865        凝胶色谱是以多孔凝胶为固定相，利用凝胶孔的空间尺寸效应，使不同大小的分子达到分离的一种色谱技术。按照流动相不同，可以将凝胶色谱分为以有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱（GPC）和以水溶液为流动相的凝胶过滤色谱。其中凝胶渗透色谱（GPC）运用较多。凝胶色谱常用于样品前处理中。        污染物较多的样品常常需要先使用凝胶净化系统进行净化，然后再使用高效液相色谱仪（HPLC）、气相色谱仪（GC）、或者是气质/液质联用仪（GC-MS/HPLC-MS）进行分析；凝胶净化系统可以有针对性地排除干扰物，从而提高分析准确性，同时可保护分析系统。        凝胶渗透分离原理：在样品分离过程中，大于尺寸排阻极限的化合物将会不受阻碍，直接通过柱子；而在工作范围内的小的化合物将会被填料截留，随着溶剂的洗脱逐渐渗透过填料的孔，随后流出柱子，从而达到样品分离的目的。