野生甘草中甘草苷和甘草酸检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA19-147Excellence in Science Excellence in ScienceLC-183 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996 岛津 Nexera LC-40 测定野生甘草中甘草苷和甘草酸含量 LC-183 摘要：本文采用岛津Nexera LC-40高效液相色谱仪建立了野生甘草样品中的甘草苷和甘草酸的同时测定方法，在14 min 内完成甘草样品分析。甘草苷在10~80 ug/mL， 甘草酸在100~800 ug/mL范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法具有简单、准确、分析时间短和溶剂消耗少等特点，可应用于野生甘草中甘草苷和甘草酸的快速检测。 关键词： Nexera LC-40甘草甘草苷甘草酸 甘草系豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat. 或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，我国甘草主要分布于内蒙古、陕西、甘肃、青海、新疆、山东等地。甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效，其主要成分为三萜类与黄酮类成分，甘草苷及甘草酸则是这两类化合物中重要的单体活性成分。甘草酸有抗炎、抗病毒等作用，甘草苷有抗抑抑、神经保护、肝脏毒性保护等作用。甘草属于大宗药材，药用和食用两方面用量都很大。近几年来，随着国家 对中药材质量监管力度的不断加大，部分甘草的甘草苷和甘草酸达不到药典的标准。2015年版《中国药典》规定，使用高效液相色谱法对甘草中甘草苷和甘草酸含量进行测定，要求干燥甘草品含甘草苷(C21H220，)不得少于0.50%，甘草酸(C42H62016)不得少于2.0%。 本实验采用岛津 Nexera LC-40 高效液相色谱系统同时测定甘草苷和甘草酸含量，该方法具有分析时间短，结果准确的特点，可为甘草中甘草苷和甘草酸含量的快速测定提供参考。 I实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津 Nexera LC-40 液相色谱仪，包括 CBM-40A Lite 系统控制器， DGU-405脱气机， LC-40B XR输送泵， SIL-40C XR 自动进样器， CTO-40S 柱温箱， SPD-M40A检测器， LabSolutions Ver. 5.97 色谱工作站。 1.2分析条件 色谱柱： SHIMADZU InertSustain C18 色谱柱(2.1mm1.D.×100 mm L.， 2um) 流动相： A：0.05%(v/v)磷酸水溶液；B：乙腈 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 检测波长：237nm 进样体积：1pL 洗脱方式：梯度洗脱，B相起始浓农为14%，时间程序如表1所示。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.50 Pumps Pump B Conc. 14 4.00 Pumps Pump B Conc. 40 10.00 Pumps Pump B Conc. 50 10.50 Pumps Pump B Conc. 100 11.00 Pumps Pump B Conc. 14 14.00 Controller Stop 1.3样品前处理 对照品溶液的制备：取甘草苷对照品和甘草酸对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成1mg/mL农度的对照品溶液储备液。使用70%乙醇，稀释成不同浓度的甘草苷和甘草酸混合对照溶液。 供试品溶液的制备：取野生甘草样品粉末(过三三筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W， 频率40 kHz) 30 min， 放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。 ■结果与讨论 2.1对照品液相图谱 按照1.2中分析条件，将浓度为 1 ug/mL的对照品溶液上机分析，色谱图如图2所示。 图2对照品溶液色谱图 2.2专属性考察 采用二极管阵列检测器(PDA)对野生甘草样品色谱图中甘草苷和甘草酸色谱峰进行峰纯度检测。结果显示甘草苷和甘草酸色谱峰最小峰纯度相似度大于0.995，且纯度指数均大于零，表明甘草苷和甘草酸色谱峰在出峰位置均未检测到杂质，峰纯度良好。可见，甘草中其他成分对含量测定无干扰，检测结果见图3和图4。 图3甘草苷色谱峰纯度检测结果 图4甘草酸色谱峰纯度检测结果 2.3线性关系考察 精密吸取对照品储备液适量，配制成不同浓度的甘草苷和甘草酸混合标准溶液，按1.2中的分析条件进行测定，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图5所示；所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表2。 图5标准曲线 表2回归方程与线性范围 化合物 校准曲线 线性范围(ug/mL) 准确度 甘草苷 Y=(5209.73)X+(521.853) 0.9999 10~80 99.1~102.5% 甘草酸 Y=(1355.13)X+(-4834.69) 0.9999 100~800 99.5~101.5% 本试验使用 SPD-M40检测器，该检测器通过“高级光学系统控温”功能可分别对流通池、光源和光学系统的温度进行控制，减少了外部温度变化对系统的影响，，可显著降低基线波动，从而可获得更加准确的目标化合物峰面积。 2.4精密度试验 精密吸取甘草苷浓度为 20 ug/mL和甘草酸浓度为 200 ug/mL 的混合对照品溶液，重复进样6次，每次进样1uL，按上述色谱条件测定峰面积。结果显示甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.53%和0.10%(n=6)，表明仪器精密度良好。 表3精密度试验结果(n=6) No. 甘草苷 甘草酸 1 104444 265169 2 105420 264935 3 105986 265468 4 105636 264788 5 106235 264776 6 105602 264749 平均值 105554 264981 峰面积 RSD 0.53% 0.10% Nexera LC-40 高效液相色谱系统配置了 LC-40B XR输送泵，可实现延时短且精度高的高压梯度洗脱。每个泵单元柱塞一次冲程的送液量为10 uL， 能够最大幅度降低流速脉动值和脉动产生周期，为仪器良好的精密度提供硬件保障。 2.5加样回收率试验 分别精密量取已知甘草苷和甘草酸含量的野生甘草样品5份，各0.2g，再加入一定量的甘草苷和甘草酸的对照储备液，按照1.3项下方法制备供试品溶液，测定回收率，结果见表4。 表4加样回收率试验结果(n=5) 取样量(g) 样品含量(mg) 加入量(mg) 测得含量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) A B A B A B A B A B 0.201 3.04 7.99 2.80 3.40 5.75 11.30 96.6 97.3 0.199 2.99 7.91 2.80 3.40 5.71 11.27 97.1 98.8 0.200 3.03 7.96 2.80 3.40 5.76 11.28 97.4 97.6 97.5 98.2 0.201 3.05 7.97 2.80 3.40 5.79 11.32 97.9 98.5 0.200 3.01 7.93 2.80 3.40 5.76 11.28 98.3 98.6 注：A为甘草苷；B为甘草酸 2.6实际样品分析结果 按照上述试验条件，对市售野生甘草样品中甘草苷和甘草酸进行检测(见图6)，计算供试品中甘草苷和甘草酸的含量分别为0.15%和3.96%，均满足2015年版《中国药典》规定的甘草中甘草苷和甘草酸含量要求。 图6野生甘草样品中甘草苷和甘草酸分析图谱 ■结论 本研究应用岛津Nexera LC-40 高效液相色谱仪建立了野生甘草样品中的甘草和和甘草酸同时测定的方法，在 14 min 内完成甘草样品分析，较传统HPLC 方法大大缩短了分析时间。甘草苷在10~80 ug/mL， 甘草酸在100~800 ug/mL范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法具有简单、准确、快速和溶剂消耗少等特点，可用于甘草样品中甘草苷和甘草酸成分的快速检测，同时为中药有效成分含量的快速测定提供参考。 Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 该方法具有简单、准确、快速和溶剂消耗少等特点，可用于甘草样品中甘草苷和甘草酸成分的快速检测。建立了野生甘草样品中的甘草苷和甘草酸同时测定的方法，在14 min内完成甘草样品分析，较传统HPLC方法大大缩短了分析时间。甘草苷在10~80 μg/mL，甘草酸在100~800 μg/mL范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法具有分析时间短，结果准确的特点，可为甘草中甘草苷和甘草酸含量的快速测定提供参考。