复方甘草制剂中吗啡 检测方案(液相色谱仪)

使用 HPLC Online SPE 方法分析复方甘草制剂中的吗啡 ● 应用 甘草，固相萃取，二维液相色谱，超高效液相色谱 作者 摘要 肖尧李浪 安捷伦科技(中国)有限公司，北京，100102 目的：建立两种复方甘草制剂中吗啡成分测定的 Online SPE-UHPLC 分析方法，进行定量分析。方法：采用 Agilent Zorbax Extend C18 柱(4.6x12.5 mm， 5 pm) 作为 Online SPE柱，采用 Agilent Poroshell 120 EC C8柱(3.0x50 mm，2.7 pm)， 以庚烷磺酸钠水溶液(A)乙腈(B)为流动相，等度洗脱，检测波长为220nm；结果：通过 Online SPE 方法可以有效去除样品中的基质干扰，回收率>95%，重现性良好，保留时间 RSD%<1%， 峰面积RSD%<1.5%， 并且取得准确的定量结果。结论：本文所建立的方法分析速度快，分离效果良好，比传统 SPE方法操作简便，使用成本低，为复方甘草制剂的质量控制提供了一种快速准确低成本的分析方法。 Agilent Technologies 在2010版中国药典中，收载了两种复方甘草制剂I11，此类制剂具有止咳祛痰的作用。其中的吗啡成分是主要药效成分，也作为质量控制的主要成分，需要进行定量分析。吗啡是一种生物碱类化合物，具有很强的极性，在 C18色谱柱上很难保留，所以药典中使用了离子对色谱法对此成分进行分析，尽管如此，吗啡的保留依然很弱，在分析过程中，很容易受到样品基质中弱保留杂质的干扰，针对此情况，药典中规定使用固相萃取 (SPE)方法对样品进行前处理，这种方法净化效果好，回收率高，可以有效去除基质中的干扰组分，但是使用成本较高，并且操作繁琐。 在本章中，我们开发了一种基于 Agilent 1200 超高效液相色谱系统的 Online SPE 方法对样品进行前处理，在提高了样品处理及分析速度的同时，降低了使用成本，经过验证，此方法回收率及重现性良好，定量准确，适合对此类制剂进行定量分析及质量控制。 实验部分 仪器与试剂： Agilent 1260 Infinity 2D-LC 液相色谱系统，配备脱气机，四元泵(2台)，自动进样器，柱温箱(内置二位六通阀)，二极管阵列检测器， SPE 柱为 Agilent Zorbax Extend C18保护柱(4.6x12.5 mm，5 pm) 色谱柱为 Agilent Poroshell 120 EC C8 柱(3.0x50mm，2.7 pm)， 数据处理软件为 Agilent OpenLab CDS ChemStation (Agilent Technologies， Inc. 美国)。庚烷磺酸钠，碳酸氢铵试剂(色谱纯， Sigma公司，美国)；甲醇，乙腈，磷酸，盐酸(色谱纯，迪马科技，北京)；超纯走由 MiliQ纯水机制备(Merck-Millipore，德国)； 吗啡标准品(标准品，国家标准物质中心)；复方甘草片，复方甘草口服液均购买自本地药店。 标准品： 秤取吗啡对照品10.2 mg， 溶解于10mL5%的乙酸水溶液中，作为储备液，再用5%的乙酸水溶液稀释100倍，得含量为 10.2pg/mL的工作溶液。 样品处理： 复方甘草口服液：量取0.5mL样品，用5%的乙酸水溶液稀释至5mL， 过 0.22 um滤膜，即得。 复方甘草片：取复方甘草片30片，精密密定，研细，精密密取取10片量，至磨口锥形瓶中，精密加水90mL， 超声提取5min， 精密加稀盐酸5mL， 超声提取20 min， 取出，放冷，过 0.22 pm滤膜，即得。 色谱条件： 仪器配置如图1所示，通过二位六通阀分别连接 SPE 柱和分析柱，样品先由泵1在SPE柱上进行净化(如图1A)， 净化完成后，通过阀切换流路将样品从SPE 柱洗脱到分析柱上(如图1B)，之后阀切换回图1A位置，样品在分析柱上继续进行分析。 图1. A：SPE 净化七B：切换组分至分析柱 Online SPE 条件： SPE柱： Agilent Zorbax Extend C18 保护(4.6x12.5 mm， 5pm)， 流动相： A=水B=甲醇，C=0.1%磷酸水溶液， D=10 Mmol/L碳酸氢铵水溶液，梯度洗脱时间见表1，流速：1mL/min，柱温： 30℃，进样量5pL。 表 1. Online SPE 梯度时间表 时间 A B C D 0 0 0 0 100 2 0 0 0 100 2.01 0 5 95 0 4 0 5 95 0 4.01 25 75 0 0 7 25 75 0 0 7.01 0 0 0 100 样品分析条件，色谱柱：Agilent Poroshell EC C8柱(3.0x50mm，2.7 um)，流动相：25Mmol/L磷酸二氢钾1.25 Mmol/L 庚烷磺酸钠水溶液(A)：乙腈(B)=83：17，等度洗脱，流速： 0.4mL/min，柱温：30℃，阀切换时间设置见表2： 表2.柱切换阀切换时间设置(按图1位置) 时间 0 3.05 3.3 阀位置 A B A 标准品分析结果 首先使用上述条件对吗啡标准品进行分析，结果见图2，从色谱图中可以看出，吗啡标准品峰型及保留状况良好，各项系统适应性参数均可满足中国药典2010版相关品种项目下的要求，与空白进样比较，无影响分析的干扰峰。 方法学考察 重现性，分别对标准品和样品连续重复进样6次，计算保留时间及峰面积 RSD 值，保留时间 RSD 均小于0.1%， 峰面积 RSD 均小于1.5%，具体数值见表3： 表3.重现性结果 标准品 复方甘草口服液 复方甘草片 保留时间 RSD 0.06% 0.04% 0.07% 峰面积RSD 1.24% 0.44% 1.31% 回收率，用标样直接进样得到的峰面积与经过 Online SPE 方法分析相同标样得到的峰面积进行比较计算回收率， Online SPE 方法的回收率可以达到95.6%。 图3为使用上述 Online SPE 方法对复方甘草口服液和复方甘草片进行分析的色谱图，可以看出，此方法对样品净化完全，可以有效的去处基质中的干扰组分，分析快速，可在10分钟内完成全部分析。 使用外标法对样品中吗啡的含量进行定量分析，并与标示含量进行比较，样品定量结果均与标示含量或合理用药量相符，结果见表4： 表4.甘草样品定量结果 实测含量 标示含量 复方甘草口服液 98.70 pg/mL 无 复方甘草片 0.39mg/片 0.36~0.44 mg/片 复方甘草口服液没有标示含量，根据说明书推荐使用剂量(每次5~10mL，每日3次)计算，每次摄入吗啡计量为 0.49~0.99 mg，每日1.47~2.97 mg。此用量在正常临床使用剂量范围之内，推断含量测定及计算结果应为正确值。 讨论 在方法开发过程中，使用10 Mmol/L碳酸氢铵溶液取代了药典当中使用的氨水溶液作为 SPE 的上样溶液，此溶液无需调节pH， 且具有一定缓冲能力，更适合于在线自动分析使用。由于使用碱性溶液，所以选择了 Agilent Zorbax Extend C18 保护柱作为 OnlineSPE 柱，这种料料的色谱柱具有独特的桥式健合技术，在高pH值的分析条件下也可以保持良好的分析效果和柱寿命，可以取代一次性 SPE 小柱反复使用，从而降低方法的整体使用成本。另外，由于保护柱采用了卡套式设计，更换方便，可以提高方法的易用性。 第二维色谱柱依据药典方法使用 Poroshell EC C8 色谱柱，有助于提高吗啡的保留， Poroshell 色谱柱具有和亚二微米填料色谱柱近似的柱效，但是反压较低，所以此方法也可以运行于常规 HPLC 系统上。 在进行流路连接时，曾经考虑过使用反冲的办法将 SPE 柱上富集的样品冲到分析柱上(如图4)，这种连接方法通常可以得到较好的峰型及较快的分析速度，但是在这个应用中，由于分析流路的流动相中含有离子对试剂，反冲到 SPE 柱上会导致 SPE 柱难以迅速平衡，所以采用了正冲的方法，直接将 SPE 柱上的收集的组分用冲洗到分析柱上，这种方法可以在被分析组分冲洗到分析柱上之后切换阀，对 SPE 柱进行冲洗和重新平衡。 为了防止样品中的干扰成分残留在 SPE 柱上导致污染及方法不稳定，在被测成分被冲洗到分析柱后，使用75%甲醇-水冲洗 SPE柱， 可以保证将 SPE 柱上强保留的干扰物冲洗干净，图5为不切阀的状况下标准品及样品在 SPE 柱上的净化情况，可以看出，在吗啡被洗脱后，增加冲洗过程可以洗脱洗留在 SPE 柱上的污染组分，避免 SPE 柱被污染，使方法更加稳定。 图4. A：SPE柱上样/净化.EB： 从SPE柱反反冲目标组分到分析柱 图5.样品在Online SPE 柱上的净化 在样品分析周期上，离线 SPE 方法在对样品进行提取后需要进行一系列的处理，包括对 SPE 小柱的活化，上样，淋洗及洗脱等，需要消耗大量的时间和溶剂，虽然仅需用6分钟即可结束液相色谱分析，但是整个样品分析过程中，前处理时间占据了绝大部分时间成为限速步骤； Online SPE 方法仅需对样品进行提取过滤即可进样，虽然液相色谱分析时间为10分钟，但是从整个样品分析周期来看，在线方法可以省去大部分样品前处理时间，比离线方法大幅节省时间，并且降低了溶剂的消耗。 图 6.离线 SPE 结果与 Online SPE 结果 A：离线SPE结果； B： Online SPE 结果 结论 本文开发了一个快速高效低成本的Online SPE 方法用于分析复方甘草制剂中的吗啡成分，方法稳定，回收率良好，可以有效去除此类样品中的基质干扰成分，取得准确的定性定量结果，比起传统的离线 SPE 方法，节省了样品前处理时间，缩短了整个样品分析周期，可以提高实验室工作效率，同时，可以降低样品分析的成本，提高实验室工作的自动化程度，适合于此类样品的日常分析工作。 ( 参考文献 ) ( 1 中国药典委员会.中国药典2010版(第一部)，北京， 2010，574 ) 更多信息 本文仅代表典型的结果。更多有关我们产品和服务，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2014 2014年3月26日，中国印刷 5991-4689CHCN Agilent Technologies 建立两种复方甘草制剂中吗啡成分测定的Online SPE-UHPLC 分析方法，进行定量分析。采用Agilent Zorbax Extend C18 柱作为Online SPE柱，通过Online SPE方法可以有效去除样品中的基质干扰，分离效果良好，比传统SPE方法操作简便，使用成本低，为复方甘草制剂的质量控制提供了一种快速准确低成本的分析方法。