大肠杆菌中DNA提取实验检测方案(化学试剂)

质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。 实验方法原理: 碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 实验材料 大肠杆菌 试剂、试剂盒 Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 异丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 无水乙醇 LB培养基 仪器、耗材 超净工作台 培养箱 摇床 恒温水浴锅 台式离心机 取液器 低温冰箱 冷冻真空干燥机 电泳仪 水平电泳槽 紫外观测仪 实验步骤: 一、材料与试剂准备 1. 材料：大肠杆菌。 2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。 3. 试剂： （1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。 （2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。 （3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。 （4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。 （5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。 二、操作步骤 1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。 2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。 3. 沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。 4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。 5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。 6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。 7. 加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。 8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。 9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。 10. 加入40 ul，3 M NaAc。 11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。 12. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。 13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。 14. 电泳检测提取DNA的质量。 质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。 实验方法原理:碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 实验材料      大肠杆菌 试剂、试剂盒      Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 异丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 无水乙醇 LB培养基 仪器、耗材   超净工作台 培养箱 摇床 恒温水浴锅 台式离心机 取液器 低温冰箱 冷冻真空干燥机 电泳仪 水平电泳槽 紫外观测仪 实验步骤:一、材料与试剂准备 ‍1.  材料：大肠杆菌。 2.  仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。 3.  试剂：（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。  二、操作步骤1.  细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。2.  离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。3.  沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。4.  重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。5.  加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。6.  加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。7.  加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。8.  离心10 min，12 000 rpm，4℃。9.  取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。10.  加入40 ul，3 M NaAc。11.  酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。12.  离心10 min，12 000 rpm，4℃。13.  取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。14.  电泳检测提取DNA的质量。