葡萄酒中琥珀酸检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-F018 图-1有机酸的化学结构式 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；有机酸 2.仪器、试剂以及耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 3.样品提取与净化 3.1样品制备 3.1.1葡萄酒样品处理 准确量取 2.0 mL的葡萄酒样品，氮吹直至含有的乙醇挥发完全，加入氢氧化钾溶液(0.1M) 调节pH值至8.0-9.0，备用。 3.1.2空白样品 空白样品以标准酒样为样品，进行上述实验操 3.1.3加标回收实验 添加不同浓度的标准品于样品基质中，进行相对应的提取方法。 质谱检测器： (MS-MS) Agilent 6410 3.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Fotector Plus or Fotector 02HT 固相萃取柱 SAX 高分子树脂型阴离子交换柱(6mL， 2g) 淋洗 淋洗液： HO 洗脱 醋酸：纯水：甲醇(5：5：90) 先以5mL 甲醇和7mL水活化小柱，以 ]mL/min 的速度上样3 mL待测液。然后以4mL纯水进行淋洗，快速气推小柱除去残留的淋洗液，最后以 5mL 的酸化乙腈进行洗脱。洗脱液氮吹至近干， 加入乙腈水的定容液(1：：1，含有0.1%的甲酸) 详细步骤见图-2。 序号 命令 溶剂 排出 流速[mL/min〕 体积(mL) 时间[minJ 1 清洗样品通道 CH30H 40 5 1.7 2 活化 CH30H 废液1 2 6 3.5 3 活化 H20 废液1 3 7 2.8 4 上样 废液1 1 4 4.5 5 清洗样品瓶 H20 废液1 50 4 4.9 6 气推 废液1 20 10 1.3 7 气推 废液1 100 20 1.5 8 清洗注射泵 5%乙酸乙腈 60 2 0.4 9 洗脱 5%乙酸乙腈 收集 1 5 5.4 10 气推 收集 20 3 0.6 11 气推 废液1 20 10 1.3 12 结束 13 图-2. Fotector Plus 葡萄酒中有机酸的 SAX 净化方法 4.检测条件 4.1液质联用检测条件 色谱柱 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5 umx21 mm x50 mm 0.300mL/min A： HO(0.1% formic acid， 5 mmol Ammonium formate)， B： 95% Acetonitrile (0.1% formic acid， 5 mmol Ammonium formate) 40°C 20 pL Agilent 6410 ESI 11 L/min 350°C 4000 35 psi 35%B (0 min~0.8 min)， 98%B (3.0 min~5.0 min)， 100%B (6.0 min~7.9 min)， 35%B(7.9 min~10.0 min) 4.2 MRM参数： 表-1.赭曲霉毒素A的串联质谱检测参数 化合物 定量离子对(碰撞能量eV、锥孔电压eV) 定性离子(碰撞能量eV、锥孔电压eV) 奎宁酸 191.2>85.2(-25，-100) 191.2>92.1(-25，-100) 酒石酸 149>87.2(-15，100) 149>73.2(-15，100) 丙酮酸 87.1>87.1(-0，-100) 87.1>43.1(-5，-100) 富马酸 115>71.1(-8，-100) 115.1>27.2(-8，-100) 苹果酸 133.2>115.1(-5，-100) 133.2>71.1(-15，-100) 酮戊二酸 145.1>101.2(-5，-100) 145.1>57.2(-5，-100) 柠檬酸 192.1>111.1(-5，100) 192.1>87.2(-15，100) 顺乌头酸 173.1>129.1(-5，-100) 173.1>85.1(-5，-100) 琥珀酸 117.1>73.1(5，100) 117.1>99.2(5，100) 4.3色谱图 图-3.9种有机酸的色谱图(10ppm) (自上而下，从左往右：1-奎宁酸2-酒石酸3-丙酮酸4-富马酸5-苹果酸6-酮戊二酸7-柠檬酸8-顺乌头酸9-琥珀酸) 5.方法可行性验证 空白葡萄酒样中添加5 mg /kg 的9种有机酸的回收率结果测试。 表-2.添加水平为5 mg/kg 的9种有机酸的回收率结果 待测物 奎宁酸 酒石酸 丙酮酸 富马酸 苹果酸 酮戊二酸 柠檬酸 顺乌头酸 琥珀酸 样品-1 96.68 28.92 91.42 96.37 74.07 6.83 1.96 7.17 94.79 样品-2 104.98 124.98 97.49 148.90 110.84 22.44 13.17 10.13 99.50 样品-3 98.19 112.20 88.50 112.58 79.24 24.65 4.02 4.94 89.90 样品-4 105.56 90.17 111.38 131.51 128.58 18.62 9.98 3.85 99.72 样品-5 113.57 121.73 97.43 144.90 115.74 25.46 10.76 4.56 96.88 回收率(%) 103.80 95.60 97.24 126.85 101.69 19.60 7.98 6.13 96.16 RSD(%) 6.50 41.50 9.06 17.48 23.43 38.85 59.65 41.72 4.21 6.结果与讨论 6.1葡萄酒样中存在较复杂的糖分和醇类干扰物，需要稀释后进行固相萃取净化，否则将会导致待测物组分的损失。 6.2如果样品中基质过于复杂，导致液质产生较强的基质效应(增强或抑制)，容易使得基质加标测试的回收率偏高或偏低，此时需要采用基质工 7.仪器优势 睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取仪具有操作便捷、精确性高和高通量等特点。在进行葡萄酒中有机酸的固相萃取时，在专门的软件操作下，通过Wifi 进行控制，具有活化、上样、清洗样品瓶、淋洗、洗脱等多种命令，使用固定式上样针和柱插杆组合、高精度注射泵精准控制流速、12通阀的切换来同时运行6个样品通道，可连续处理60个样品，批量检测提供便捷帮助。 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站可实现标准品的全自动化配制，重现性好，准确 作曲线进行校正。 6.3葡萄酒样品中存在大量的有机酸，加标量应适当增大，否则加标回收不明显。其中对于多元酸， SAX 填料对其吸附能力不强，如酮戊二酸，柠檬酸等，对于此类待测物，建议完全旋蒸除去葡萄酒中的乙醇后，再进行样品前处理测试。 性高，减少了实验员配制过程中溶剂挥发严重而对身体带来的伤害，也防止在配制过程中发生漏取、错取、体积不对等情况，避免造成整批的标准品的报废。 睿科 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪可一次性平行浓缩60位样品，处理样品通量高的同时，操作简单便捷，可智能判断浓缩过程，通过软件控制氮吹针自动跟随浓缩液面下降，浓缩效率高，消耗氮气量少。 ERini 公 全自动液体样品处理工作样品提取 全自动固相萃取仪样品净化 全自动浓缩仪样品浓缩 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 有机酸是在中草药的叶、根、特别是果实中广泛分布，如乌梅、五味子，覆盆子等。常见的植物中的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸如酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸（即维生素C）等，芳香族有机酸如苯甲酸、水杨酸、咖啡酸等。除少数以游离状态存在外，一般都与钾、钠、钙等结合成盐，有些与生物碱类结合成盐。本文集参考GB 5009.157标准对葡萄酒中的有机酸进行固相萃取净化的前处理方法，采用LCMS对其进行定量定性分析。