水中洛美沙星药物残留检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-W001 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定水中沙星类抗生素药物残留 沙星类 (Quinones， QNs)抗生素(图-1)是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。但研究表明，所使用的抗生素仅20~30%被鱼类吸收，大部分进入环境中，而这部分抗生素再次进入食物链，可能导致养殖环境中病菌耐药性的产生，导致二次污染。这 不仅影响到水产养殖业的健康发展，而且还威胁着生态环境的安全。水样中残留喹诺酮类抗生素，通过饮用进入人体，可能对人体肝脏功能造成严重损伤。因此，建立水环境中这类药物的检测方法尤为重要。目前，喹诺酮类药物残留检测方法，主要包括HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-DAD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS，另外还有荧光光谱法、毛细管电泳法和酶联免疫法等。 噁喹酸 依诺沙星 奥比沙星 沙拉沙星 司帕沙星 图-1.16种沙星类抗生素的结构式 本实验选择MCX阳离子交换柱进行富集、净化， 术检测，建立了环境水样中高灵敏的分析方法，该超高压液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)联用技 方法有望应用于水产养殖中。 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；抗生素 2.仪器、试剂以及耗材 3.1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 60位 固相萃取柱 MCX (Waters， 200 mg/6 mL) 活化 甲醇 淋洗 pH=4.0的甲酸水溶液 洗脱 5%的氨水甲醇溶液 3.2富集净化 依次用甲醇(10mL)和水(10mL) 以 5.0mL/min 的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，备用。取纯净水样200 mL，如为加标样品，请加入标准品 (100 pL， 100 ppb)， 加入EDTA-MCIlvaine 缓冲溶剂(50mL，0.1 mol/L)调节水环境的 pH为4，以 5 mL/min 的速率经固相萃取小柱富集后；用甲酸水溶液(pH=4.0)10 mL 以10 mL/min 速率淋洗；气推后用10 mL 的5%氨水甲醇以 1.0 mL/min 的速率洗脱。收集的样品在25℃， 5 psi 条件下浓缩至近干，流动相乙腈-水溶液(10： 90， v/v， 0.1%甲酸)定容至1.0mL，供LC/MS-MS分析。全自动固相萃取方法见图-2。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间(min 1 活化 MeOH Methanol) 废液2 5 10 2.6 2 活化 pH4.0 Formic Acid/Water 废液1 10 10 1.6 3 大体积上样 sample-1 废液1 6 200 115.3 4 淋洗 pH4.0 Formic Acid/Water 废液1 5 10 2.6 5 气推 废液1 30 20 2 6 洗脱 5%ammonia/MeOH 收集 1 10 10.5 7 气推 20 5 0.8 8 结束 图-2. Fotector Plus水中沙星抗生素固相萃取方法 4.液质检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5 pmx2.1 mmx50 mm 0.200 mL/min A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 30°℃ 10 pL Agilent 6410 ESI 11 L/min 350°C 4000 35psi 0.0-1.0 min， 90%流动相A；1.0-4.0 min， 50%的流动相；50%流动相A 保持2 min； 6.01-7.01 min， 90%的流动相A； 7.01-10.0 min， 90%的流动相A 保持3 min 4.2 MRM 参数 表-1.16种抗生素的串联质谱检测参数 4.316种沙星类抗生素的保留时间谱图 图-3.16种喹诺酮标准物质的 MRM色谱图(5ng/mL， 进样量10pL) 5.1基质效应验证 取纯净水样，按照上述的样品处理步骤后，氮吹至近干，加入标准使用液(1 ppm， 20 pL)，定容成1mL， 供 LC/MS-MS检测。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用含有基质的工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求 R’>0.99；此曲线两 周需要重新配置一次。 5.2样品基质加标测试 对桶装纯净水和生活废水进行加标实验，加标浓度为低浓度(25 ng/L)、中浓度(50 ng/L)和高浓度(100ng/L)， 结果如表-2所示：除了恩诺沙星和司帕沙星在76.9~79.4%外，大部分的加标回收率在82.5~114.2%之间， RSD 1.5~16.6%。该方法能够实现对水样中16种喹诺酮抗生素进行检测。 桶装纯净水加标浓度(n=6) Concentration of standard spiked martrix samples (ng/L) 生活废水加标浓度(n=4) Concentration of standard spiked martrixsamples(ng/L) 化合物Compounds 25 50 100 25 100 平均回收率(%) RSD(%) 平均回收率(%) RSD(%) 平均回收率(%) RSD(%) 平均回收率(%) RSD(%) 平均回收率(%) RSD(%) 伊诺沙星 109.0 10.3 95.5 7.5 107.6 6.4 99.0 10.3 86.7 9.7 氟罗沙星 102.5 12.9 104.0 3.0 114.3 4.6 92.5 12.9 94.9 14.6 诺氟沙星 114.2 12.6 100.0 6.3 112.4 2.0 104.2 12.6 99.7 11.1 氧氟沙星 107.7 6.1 102.8 4.0 114.2 4.0 107.7 6.1 100.3 6.4 培氟沙星 110.9 6.0 91.3 8.5 114.1 1.5 100.9 6.0 97.3 13.3 环丙沙星 104.7 7.4 100.7 6.4 104.1 2.4 104.7 7.4 89.2 16.6 洛美沙星 104.2 7.4 107.5 7.3 109.7 7.3 104.2 7.4 107.9 15.4 丹诺沙星 107.7 14.9 101.1 6.5 114.7 3.8 107.7 14.9 90.9 12.4 恩诺沙星 99.6 9.0 77.4 7.3 110.3 9.8 79.6 9.0 95.0 5.1 奥比沙星 93.5 10.3 97.5 8.0 106.0 8.2 93.5 10.3 95.8 2.5 沙拉沙星 100.2 7.4 113.2 4.4 96.4 6.6 100.2 7.4 84.5 4.0 双氟沙星 97.9 12.0 94.7 6.0 111.9 9.8 97.9 12.0 90.0 9.3 司帕沙星 76.9 8.4 95.2 4.2 88.6 14.4 76.9 8.4 84.3 1.8 氟甲喹 99.6 10.4 105.7 6.0 102.2 5.6 99.6 10.4 82.5 3.0 噁喹酸 99.6 10.4 103.2 7.4 99.7 9.4 99.6 10.4 83.2 3.7 萘啶酸 110.9 6.6 99.9 6.5 99.3 7.1 110.9 6.6 86.5 2.8 5.3不同类型固相萃取柱对沙星类化合物的富集效果 取纯净水为样品，加标的质量浓度分别为 50ng/L， 按照上述方法，进行4平行样测定，考察该方法的不同固相萃取柱的回收率和重现性，分析结果如图-4所示：纯净水中抗生素的平均回收率分布在 65.00-91.38%(HLB)， 71.21-152.28%(MAX)和77.41-123.21%(MCX).HLB 回收率普遍偏低， MAX 柱中沙星的回收率偏高，培氟沙星和氧氟沙星的回收率均超过了 140%，而且 MAX 柱需要在水样中加入氢氧化钠，容易造成水样中金属离子的水解沉淀，容易造成管路的堵塞。相比之下 MCX 柱的平行性比 HLB 柱和 MAX好，回收率大部分在90%-110%之间，除了恩诺沙星回收率偏低，只有77.41%。 图-4.三种柱子的回收率对比 6.结果与讨论 6.1对于16种沙星类化合物在水中的富集方法，应考虑实验过程中基质对化合物检测的干扰。此步的干扰不仅来自于水样中杂质干扰，同时商业化的固相萃取小柱，使用的色谱级溶液等等都存在干扰杂质，因此需要进行基质效应确认，以避免前处理富集过程中存在基质效应。 6.2氮吹浓缩过程中应控制吹干程度，不可过分干燥。 7.仪器优势 睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取仪可同时进行6个样品处理，兼容一般食品样品，也满足大体积水样的处理。从活化、上样、淋洗到洗脱等多种基础命令，都由高精度注射泵、12通阀、固定式上样针和柱插杆组合而成最短的流路系统，与自带补偿的软件相互配合，在自动化运行的同时，还大大 6.3对于沙星类的两性化合物，在 pH=7.0左右时，主要以带负电荷的形式存在水溶液中，此时进行富集，固相小柱无法对目标物进行吸附。因此需要进行 pH调节至4.0左右，使其成为带铵根的正离子，利于下一步进行阳离子交换柱富集。 6.4淋洗时采用甲酸酸化的水溶液，利于将固相萃取小柱中残留的 EDTA 除去，避免其在后续的洗脱液中干扰沙星类化合物的检测。 提高了仪器精度，保证了回收率。 睿科 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪能够与睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取仪进行完美搭配，二者氮吹试管架与收集架能够完美兼容，便捷的操作软件能将手动浓缩仪的氮吹针下降调整自动化，使得净化与浓缩一步到位，省时省力省气。 网址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线： 网址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线： 目前，喹诺酮类药物残留检测方法，主要包括HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-DAD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS，另外还有荧光光谱法、毛细管电泳法和酶联免疫法等。