食品中反式脂肪酸甲酯检测方案(气质联用仪)

thermoscientific 质谱方法优化 TSQ 8000 Evo 三重四极杆气质联用仪测定反式脂肪酸甲酯的 Timed-SRM 解决方案 前言 反式脂肪酸(Trans Fatty Acids， 简称 TFA)，包括单不饱和反式脂肪酸和多不饱和反式脂肪酸，其化学结构分别对应一个或多个非共轭的双键构型。在人工催化普通植物油为“氢化植物油”的过程中，有一部分剩余不饱和脂肪酸发生了“构型转变””，，从天然的“顺式”结构异化为“反式”，即为TFA。研究表明，大量使用含 TFA的食物会加速动脉硬化，导致心脑血管疾病、冠心病、糖尿病和老年痴呆症等[1]，反式脂肪酸问题在食品安全领域已经引起了全社会的广泛关注。2016年8月31日发布的GB 5009.257-2016《食品中反式脂肪酸的测定》于2017年03月01日正式实施，该标准将反式脂肪酸的分析物扩充至 C16：1t~C22：1t，共15种反式脂肪酸。 本文应用赛默飞三重四级杆气质联用仪 TSQ 8000 Evo结合赛默飞脂肪酸分析专用色谱柱 TR-FAME，建立了反式脂肪酸的分析方法。利用二级质谱扫描，大大降低复杂基质样品中背景干扰的影响，大大提高化合物的检测灵敏度。 试剂和仪器 质谱仪：TSQ 8000 Evo 三重四极杆串联质谱仪(赛默飞世尔科技，美国)； ( 气相色谱仪： Trace 1310 气相配 TriPlus RSH 自动进样器(赛默飞世尔科技，美国)； ) ( 色谱柱： TR-FAME (100 m * 0.25 mm * 0.20 um) 毛细管色 谱柱(赛默飞世尔科技，美国)； ) ( 试剂：异辛烷、氢氧化钾甲醇溶液 ) 样品前处理方法 参考 GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的测定》、GB5009.257-2016《食品中反式脂肪酸的测定》中酯交换法进行样品前处理。 气相色谱 升温程序：150℃保持1min， 以25℃/min 升温到200℃，以4℃/min 升温到215℃，保持10 min， 再以20℃ /min升温到240℃并保持3min； 载气：氦气，1.0mL/min(恒流)； 进样口：240℃； 进样方式：分流进样(分流比：30：1) 进样量：1uL 电离方式：电子轰击电离(El)，电子能量 70eV；离子源温度：250℃；传输俞温度：250℃；扫描模式：采用 Timed-SRM 方法扫描； 气相分离方法建立 待测的15种反式脂肪酸包含多种同分异构体，常规分析(GB 5009.257-2016)采用 GC-FID配 100m聚二氰丙基硅氧烷色谱柱分离，分析时间较长(50min)，且 C18： 11、C18：3的多个同分异构体无法基线分离，如图1所示。 图1.反式脂肪酸甲酯混合标准溶液气相色谱图(引自GB 5009.257-2016) 本文用赛默飞 TR-FAME (100 m*0.25 mm*0.20 pm) 脂肪酸分析专用毛细管色谱柱，结合TSQ 8000 Evo 三重四极杆气质联用仪，在化合物基本完全分离的前提下(图2-4)，将程序升温调整为21分钟，显著提高分析效率。 RT：9.71-16.99SM：7B 图2.反式脂指酸甲酯混合标准溶液 GC-MS/MS 总离子流图(TIC) 图3.截取图2-A三种 C18：1反式脂肪酸甲酯标准溶液分离效果图(TIC) 图4.截取图2-A六种 C18：3反式脂肪酸甲酯标准溶液分离效果图(TIC) 现今，脂肪酸甲酯的常规检测通常使用 GC-MS的选择离子扫描(SIM)模式替代传统的 GC 检测， SIM 模式下质谱只扫描选定的定量(定性)离子，能获得较好的定性、定量结果。然而，对于低浓度样品，尤其是复杂基质样品，SIM 模式无法完全去除干扰，检测结果容易受到影响。相较于单四极杆GC-MS， 三重四极杆 GC-MS可兼容多种扫描模式，其中 SRM 选择离子对扫描可以通过二级质谱的模式采集离子对信息，有效去除基质干扰，提高灵敏度。如图5所示，低浓度样品中， SIM 模式采集 C18：3 的基峰79 m/z时， RT 15.7-16.1的四个 C18：3的同分异构体色谱峰响应较差，基线干扰严重；而在 SRM 选择离子对扫描 模式下， C18：3无论是峰面积还是信噪比都明显优于 SIM模式的结果。另一方面，脂肪酸甲酯的El质谱图中丰度较高的离子 m/z较小(如：41、55、69、74等)，并不是母离子的最佳选择，但在常量分析对它们进行选择离子扫描(SIM)可以获得较好的响应。因此，本文在 Timed-SIM 方法的基础上，采用 Timed-SRM 模式，建立了一种灵活结合选择离子和选择离子对的扫描模式，以零碰撞能SRM模式作常规定量分析，同时用常规SRM 模式进行确证和干扰排除，大大提高分析准确和灵敏度。最终优化出的质谱条件如表1所示。 表1.反式脂肪酸甲酯 Timed-SRM & Timed-SIM 离子对信息 将标准样品配置为系列标准溶液，按上述 Timed-SRM 方法进行数据采集。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；用标准曲线最低点重复进样8次，计算得到反式脂肪酸甲酯的仪器检出限；并通过加标样品考察乳粉基基中反式脂肪酸甲酯的重现性，结果如表2所示。 表2.反式脂肪酸甲酯线性方程、线性范围、仪器检出限和RSD% No. 化合物 线性方程 线性范围 mg/L 相关系数 仪器检出限 ug/L RSD% 1 C16：1 9t Y=8.409e4X-8.876e4 0.25-100 0.9990 19.8 3.56 2 C18：1 6t Y=7.789e4X-5.329e4 0.25-100 0.9997 39.7 2.95 3 C18：1 9t Y=5.614e4X-4.719e4 0.25-100 0.9996 58.1 3.64 4 C18：1 11t Y=5.436e4X-4.966e4 0.25-100 0.9995 54.2 2.90 5 C18：2 9t，12t Y=1.010e5X-1.159e5 0.25-100 0.9991 45.9 5.13 6 C18：3 9t，12t，15t Y=3.633e5X-5.040e5 0.075-30 0.9985 5.0 2.49 7 C18：3 9t，12t，15c Y=1.269e5X-1.693e5 0.038-15 0.9983 2.4 3.32 8 C18：3 9t，12c，15t Y=7.693e4X-9.696e4 0.038-15 0.9987 7.6 3.54 9 C18：3 9c，12t，15t Y=7.809e4X-1.034e5 0.038-15 0.9985 7.3 7.92 10 C18：3 9c，12c，15t Y=2.571e4X-3.228e4 0.0175-7 0.9984 9.1 5.25 11 C18：3 9c，12t，15c & C18：3 9t，12c，15c Y=2.176e4X-2.522e4 0.035-14 0.9988 19.1 1.16 12 C20：1 11t Y=5.327e4X-7.958e4 0.25-100 0.9986 53.3 5.51 13 C18：2 10t，12c Y=4.534e4X-5.546e4 0.25-100 0.9987 44.8 4.51 14 C22：1 13t Y=6.216e4X-5.592e4 0.25-100 0.9996 19.9 5.62 ( [1]谢明勇，谢建华，杨美艳，等.反式脂肪酸研究进展[J]. 中国食品学报，2010(4)：14-26. ) 结论 本方法使用赛默飞 TSQ 8000 Evo 三重四级杆气质联用仪结合 TR-FAME 脂肪酸分析专用柱，建立了一套 Timed-SRM 分析15种反式脂肪酸甲酯的方法，通过串联质谱有效地降低基质干扰，提高分析的准确度和灵敏度。并结合GB 2009.257-2016《食品中反式脂肪酸的测定》中的前处理方法，通过乳粉沐品对方法进行验证。该方法操作简单、灵敏度高、重现性好，完全符合对食品中反式脂肪酸的检测要求。 SCIENTIFIC 热线话ww.thermofisher.com 反式脂肪酸（Trans Fatty Acids, 简称TFA），包括单不饱和反式脂肪酸和多不饱和反式脂肪酸，其化学结构分别对应一个或多个非共轭的双键构型。在人工催化普通植物油为“氢化植物油”的过程中，有一部分剩余不饱和脂肪酸发生了“构型转变”，从天然的“顺式”结构异化为“反式”，即为TFA。研究表明，大量使用含TFA 的食物会加速动脉硬化，导致心脑血管疾病、冠心病、糖尿病和老年痴呆症等，反式脂肪酸问题在食品安全领域已经引起了全社会的广泛关注。2016 年8 月31 日发布的GB 5009.257-2016《食品中反式脂肪酸的测定》于2017年03 月01 日正式实施，该标准将反式脂肪酸的分析物扩充至C16:1t~C22:1t，共15 种反式脂肪酸。本文应用赛默飞三重四级杆气质联用仪TSQ 8000 Evo 结合赛默飞脂肪酸分析专用色谱柱TR-FAME，建立了反式脂肪酸的分析方法。利用二级质谱扫描，大大降低复杂基质样品中背景干扰的影响，大大提高化合物的检测灵敏度。