水中19种磺胺类抗生素药物检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2019-W006 水中19种磺胺类抗生素药物的测定解决方案 1.介绍 磺胺类药物(Sulfonamides， SAs) 是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。SAs 种类可达数千种，其中应用较广并具有一定疗效的就有几十种，常见的磺胺类药物见图-1。磺胺药是现代医学中常用的一类抗菌消炎药，其品种繁多，已成为一个庞大的“家族”了。但是磺胺药会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎，肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。养殖场及屠宰场的废水常含有高浓度的磺胺类药物残留，因此此于水质中磺胺的检测需求日益增大。 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；磺胺抗生素； Fotector Plus； AutoEVA-60 H2N、 H2N、 H2N 、 H2N、 H2N NN- ON. N- H2NNNH2S， IO N H O H O、 磺胺醋酰 磺胺嘧啶 磺胺噻唑 磺胺吡啶 磺胺甲基嘧啶 甲氧卞啶(TMP)H2N H2N H2N H2N H2N、 0H2N. O. N= O )N=A 5N-N.C N=O SHO磺胺6-甲氧基嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺氯哒嗪 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺邻二甲氧嘧啶H2NH2N、 H2N、 H2N、 H2NH2N -O.N-N C N-0 O - N NNNOH SS S`N S )H oHONOH H2N 1--N OH 磺胺二甲嘧啶 磺胺甲噻二唑 磺胺甲基异噁唑 磺胺二甲噁唑 磺胺二甲氧基噁唑 磺胺喹噁啉 磺胺苯吡唑 图1.19种磺胺类抗生素结构图 2.仪器和耗材 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪 HLB固相萃取柱 (CNW， 200 mg/6mL or 500mg/6mL) 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260，质谱检测器(MS) Agilent 6410 甲醇，甲酸，氨水(优级纯) 3.样品前处理 3.1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 Fotector Plus高通量全自 动固相萃取仪 固相萃取柱 HLB (Waters， 60 mg/3 mL) 活化 甲醇 淋洗 pH=4.0 的甲酸水溶液 洗脱 甲醇溶液 3.2富集与净化过程 依次用甲醇(10mL)和水(10mL)以 5.0 mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，备用。取纯净水样200mL，加入 EDTA-McIlvaine 缓冲溶剂(50mL，0.1 mol/L)调节水环境的 pH为4.30左右，以5-7 mL/min 的速率经固相萃取小柱富集后；用甲酸水溶溶液(pH=4.0) 10 mL 以10 mL/min 速率 淋洗；气推后用 10 mL 的甲醇以1.0 mL/min 的速率洗脱。收集的样品在35℃， 5 psi 条件下浓缩至近干，流动相乙腈-水溶液(10：90，v/v，1% 甲酸)定容至1.0 mL，供LC/MS-MS分析。详细的固相萃取流程见下图-2。 No Step Source Output Flowe (mL/min)/Ter Volume (mL) Time( 1 Condition CH30H Waste2 20 5 0.5 2 Condi ti on pH=4.0 formic... Wastel 10 5 0.7 3 Load sample Wastel 5 250 64.6 4 Rinse pH=4.0 formic... Waste1 20 10 0.8 5 Dry 14 6 Rinse Syringe CH30H 20 5 0.5 7 Elute CH30H Collect 1 10 10.3 8 Air push Collect 20 5 0.6 9 End 10 图2. Fotector Plus 对水中磺胺类药物的固相萃取富集方法 4.检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 4.2 MRM参数 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage 磺胺醋酰 215 155.9 15 63 9 4 108 15 63 17 4 磺胺嘧啶 251 185.1 15 103 13 4 156 15 103 9 4 磺胺噻唑 256 156 15 98 9 4 108.1 15 98 21 4 磺胺吡啶 250 184.1 15 107 13 4 155.9 15 107 13 4 磺胺甲基嘧啶 265 172 15 102 13 4 156 15 102 13 4 甲基苄胺 291 261.1 15 142 21 4 230.1 15 142 21 4 磺胺二甲基嘧啶 279 186 15 107 13 4 155.9 15 107 13 4 磺胺甲噻噁唑 271 156 15 88 9 4 108 15 88 21 4 磺胺对甲氧嘧啶 281.1 126 15 112 21 4 磺胺6-甲氧基嘧啶 281 215.1 15 117 13 4 156 15 117 13 4 磺胺甲氧哒嗪 281 156 15 107 13 4 108 15 107 25 4 磺胺氯哒嗪 285 156 15 98 4 108.1 15 98 21 4 磺胺间二甲氧基嘧啶 311.1 245.1 15 127 13 4 156 15 127 17 4 磺胺邻二甲氧基嘧啶 311 156 15 117 13 4 108 15 117 25 4 磺胺甲基异噁唑 254 156 15 103 13 4 147.1 15 103 9 4 woooyAeIMMM 294 15 198 15 表1.18种磺胺的串联质谱检测参数 10 4 17 4 表1.18种磺胺的串联质谱检测参数 4.3色谱图 下图为18磺胺类化合物标准溶液(20 ppb)在液质中的色谱图： 22+ESI MRM Frag=127.0V CF=0.000 DF=0.000 CIDe17.0 (311.1000->156.0000)C06.d磺胺间二甲氧基嘧啶 0 1 +ESI MRM Frag=127.0V CF=0. 000 DF=0. 000 CIDe21.0 (315.0000-)159.7000) C06.d磺胺苯吡唑 为了验证该方法的回收率，本实验向纯净水(200 mL)中加入上述19种磺胺类标准品(10 uL，1mg/L)进行加标回收验证(n=4)。测试结果如表2所 示，17种磺胺的回收率在80.00-120.00%之间，只有磺胺酒酰和甲基基胺的回收率分别在73.94%和75.07%。19种磺胺4平行样的相对标准偏差均控制在15%以内。说明该方法能够很好地运用于水样中19 种磺胺类羊品的检测。 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 Average 样品-1 样品-2 样品-3 样品-4 RSD(%) (Compound) Recoveries Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 (%) 磺胺醋酰 76.12 71.42 72.48 75.73 73.94 3.17 磺胺嘧啶 102.04 111.53 82.20 88.42 96.05 13.78 磺胺噻唑 88.06 106.16 86.27 84.85 91.33 10.92 磺胺吡啶 91.66 114.36 90.79 97.87 98.67 11.07 磺胺甲基嘧啶 90.51 116.31 92.22 96.55 98.90 12.02 甲基苄胺 69.17 84.20 75.14 71.76 75.07 8.74 磺胺二甲嘧啶 99.44 108.02 99.53 87.70 98.67 8.46 磺胺甲噻唑 114.98 117.08 117.74 112.59 115.60 2.01 磺胺对甲氧基嘧啶 102.96 117.69 94.35 96.66 102.92 10.20 磺胺邻甲氧嘧啶 102.96 117.69 90.61 86.66 99.48 14.06 磺胺甲氧哒嗪 104.92 115.71 100.90 89.26 102.70 10.64 磺胺氯哒嗪 89.10 98.40 91.74 97.00 94.06 4.65 横胺间二甲氧嘧啶 106.12 114.66 96.60 88.92 101.58 11.03 磺胺邻二甲氧嘧啶 106.12 114.66 96.60 88.92 101.58 11.03 磺胺甲基异噁唑 105.28 114.09 97.87 90.44 101.92 9.93 磺胺二甲基噁唑 110.83 121.61 96.63 90.43 104.88 13.39 磺胺二甲氧基噁唑 110.83 121.61 96.63 90.43 104.88 13.39 磺胺喹噁啉 101.33 118.79 96.63 96.81 103.39 10.15 磺胺苯吡唑 78.56 93.02 96.63 71.24 84.86 14.11 表2.19种磺胺的加标回收率及 RSD 值(50 ng/L) 6.结果与讨论 6.1对于磺胺类的两性化合物，在 pH=7.0 左 右时，主要以带负电荷的形式存在水溶液中，此时进行富集，固相小柱无法对目标物进行吸附。因此需要进行 pH调节至4.0左右，使其羧酸根部分不电离，增强其在固相萃取柱上的吸附能力。 分干燥。 7.解决方案的优势 6.2淋洗时采用甲酸酸化的水溶液，利于将固相萃取小柱中残留的 EDTA 除去，避免其在后续的洗脱液中干扰沙星类化合物的检测。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪能同步进行6个样品处理，自动连续处理60个样品，从活化、上样、淋洗到洗脱等多种基础命令全部实现自动化，大大提高了仪器精度和可靠性，保证了回收率。 6.3氮吹浓缩过程中应控制吹至近干，不可过 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪可自动完成对样品的快速，平行浓缩。 全自动固相萃取仪净化 全自动平行浓缩仪浓缩 热线： 网址：：Vwww.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线：址：：Vwww.raykol.com 磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。SAs种类可达数千种，其中应用较广并具有一定疗效的就有几十种，常见的磺胺类药物见图-1。磺胺药是现代医学中常用的一类抗菌消炎药，其品种繁多，已成为一个庞大的“家族”了。但是磺胺药会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎，肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。养殖场及屠宰场的废水常含有高浓度的磺胺类药物残留，因此对于水质中磺胺的检测需求日益增大。